噬菌體展示技術(shù)鑒定hSAMP32與hPH20抗原表位.pdf

1、背景與目的：抗原表位,又稱抗原決定簇,是抗原分子抗原性的基礎(chǔ)。正確而詳細(xì)地繪制抗原表位圖譜對疾病的診斷、設(shè)計無毒副作用的多表位疫苗以及免疫治療試劑等具有積極的意義。噬菌體展示技術(shù)作為近年來新興起的研究蛋白質(zhì)抗原表位的有利工具,已經(jīng)成功地鑒定出了多種病原微生物的抗原表位。這就為揭示一些病原體未知的抗原表位,從而進(jìn)一步達(dá)到預(yù)防和控制疾病的發(fā)生提供了條件?？咕涌贵w(anti-sperm antibodies,ASAB)是男性體內(nèi)的一種自身抗

2、體,對于女性屬于同種異體抗體,9％~36％的不育夫婦體內(nèi)含有ASAB(男性占8％-21％,女性占6％-23％)。已證明ASAB是免疫不育的病因,同時ASAB抗體又可以用于人類避孕疫苗的研究,理想的CV精子抗原特異性表達(dá)于精子表面,涉及精子卵透明帶結(jié)合,并且和人類免疫不育有關(guān)。比較顯著的有受精抗原(fertilization antigen,FA-1)、透明質(zhì)酸酶PH20、精子蛋白10(sperm protein,SP-10)、人精子頂體

3、膜相關(guān)蛋白32(Human Sperm Acrosomal Membrane-AssociatedProtein32,hSAMP32)等。PH20和SAMP32都是GPI錨定的精子特異性的膜蛋白。雖然對hPH20和hSAMP32在免疫性不孕中的作用也有報道,但迄今為止,對于hPH20和hSAMP32的抗原表位還沒有報道。為深入了解hSAMP32和hPH20的抗原結(jié)構(gòu),便于設(shè)計科學(xué)合理的疫苗和診斷,我們對hPH20和hSAMP32進(jìn)行了抗

4、原表位的鑒定。
　　材料與方法：1本研究利用分子生物學(xué)方法將hPH20和hSAMP32基因從本課題組保存的菌株中提取質(zhì)粒DNA,BamHⅠ/XhoⅠ雙酶切鑒定并DNA測序,將質(zhì)粒DNA純化作為模板保存。利用生物學(xué)軟件Primer premier5.0軟件分別設(shè)計hSAMP32,hPH20基因的分段引物,分為Sa,Sb,Sc;Pa,Pb,Pc,Pd。所有引物上游酶切位點(diǎn)是EcoRI,下游是HindⅢ所用載體為T7select10-3

5、b,各個片段經(jīng)PCR擴(kuò)增后與T載體連接,轉(zhuǎn)化,測序。2各個片段酶切純化后與T7噬菌體載體相連,經(jīng)體外包裝后展示在T7噬菌體表面,構(gòu)建了hPH20和hSAMP32基因特異性肽庫。3利用ASAB陽性血清進(jìn)行了5輪篩選,淘選出5段基因片斷,結(jié)合TMHMM在線分析結(jié)果。4在Pa,Sa抗原表位所在區(qū),經(jīng)蛋白質(zhì)抗原表位生物學(xué)軟件分析設(shè)計合成表位肽。5 ELISA鑒定表位肽的生物反應(yīng)性,SPSS統(tǒng)計分析。
　　結(jié)果：1 Sa,Sb,Sc;Pa,

6、Pb,Pc,Pd經(jīng)測序?yàn)槟康幕?分別為343bp,343bp,352bp,400bp,403bp,397bp,367bp。2 hPH20和hSAMP32基因特異性肽庫構(gòu)建成功,庫容為2×10~5pfu/mL。3 Pa,Sa為抗原表位所在區(qū)。4表位肽SAMP32:6 AVQDAGL A H E G E G E E E T E;37 E T E D V S N R N V V K E V E FG M;76 E S K C V V R V