鹽酸克侖特羅ELISA方法的建立及用噬菌體展示技術(shù)篩選其模擬表位.pdf

1、鹽酸克侖特羅(Clenbuterol，CLB)，俗稱(chēng)瘦肉精，是一種β<,2>-腎上腺素受體激動(dòng)劑。作為治療哮喘藥物已經(jīng)有30多年了。不幸的是這類(lèi)藥物被非法用來(lái)作為家畜的生長(zhǎng)促進(jìn)劑，用以改善營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)在脂肪和肌肉之間的重新分配，增加瘦肉。這種非法應(yīng)用會(huì)對(duì)食用殘留有此類(lèi)藥物畜產(chǎn)品的消費(fèi)者產(chǎn)生毒害作用，給人民的身體健康和生命安全造成潛在的危害。因此，世界上許多國(guó)家都禁止在畜牧業(yè)上使用鹽酸克侖特羅。為了防止對(duì)人類(lèi)的危害，必須建立快速、靈敏、有效的

2、檢測(cè)方法。ELISA方法檢測(cè)鹽酸克侖特羅殘留是一種快捷、可靠的方法，可在實(shí)際檢測(cè)中應(yīng)用。噬菌體肽庫(kù)展示技術(shù)近年來(lái)發(fā)展很快，可以用來(lái)淘選CLB替代抗原的模擬表位。這也為其它小分子半抗原物質(zhì)的ELISA方法的建立提供新的思路。 本論文主要包含兩部分內(nèi)容： 1 建立鹽酸克侖特羅間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)方法。 2 用噬菌體肽庫(kù)展示技術(shù)淘選鹽酸克侖特羅替代抗原的模擬表位。 第一部分包括鹽酸克侖特羅偶聯(lián)抗原的合成，

3、單克隆抗體的純化和效價(jià)的測(cè)定，ELISA各個(gè)影響因素最佳條件的優(yōu)化，該ELISA方法性能的評(píng)價(jià)等。根據(jù)實(shí)驗(yàn)建立了鹽酸克侖特羅間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)方法，包被偶聯(lián)抗原為0.5ng/mL，加入CLB單抗原液稀釋為1:250000，酶標(biāo)二抗原液稀釋為1:5000。其間接競(jìng)爭(zhēng)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)其線(xiàn)性范圍為0.38-50ng/mL，IC<,50>為6.25ng/mL，檢測(cè)下限為0.19ng/mL。曲線(xiàn)方程為y=35.149x+19.145，R=0.9937

4、8。批內(nèi)和批間的變異系數(shù)分別為8.3％和9.97％。進(jìn)行樣品加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，平均回收率為93.14％。 第二部分包括以抗CLB的單克隆抗體為靶分子，從噬菌體隨機(jī)7肽庫(kù)中進(jìn)行4輪親和淘選。從第4輪噬菌平板上隨機(jī)挑選18個(gè)噬菌斑，經(jīng)間接ELISA和間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA鑒定，挑選出6個(gè)合適的噬菌體。經(jīng)測(cè)序可知其序全列為N-His-His-Thr-Phe-Phe-Lys-His-C。用噬菌體P8替代CLB抗原建立了間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)