噻蟲啉模擬表位的篩選及噬菌體酶聯(lián)免疫分析方法研究.pdf

1、合成了噻蟲啉半抗原，采用混合酸酐法將噻蟲啉半抗原與卵清蛋白(OVA)偶聯(lián)制備了包被抗原;與牛血清蛋白(BSA)偶聯(lián)制備了免疫抗原用于免疫BALB/c小鼠。將骨髓瘤細(xì)胞SP2/0與免疫過的小鼠脾臟細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞融合制備雜交瘤細(xì)胞。通過系列篩選和亞克隆，最后得到能穩(wěn)定分泌抗噻蟲啉單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株(3A5)。將3A5雜交瘤細(xì)胞株注射小鼠腹內(nèi)制得腹水，采用辛酸-硫酸銨法純化腹水得到抗體?；趩慰寺】贵w建立了噻蟲啉間接競爭ELISA方法，并

2、對抗原抗體濃度和工作溶液（甲醇含量、離子強(qiáng)度、pH值）進(jìn)行優(yōu)化。在最佳優(yōu)化的條件下（5％甲醇PBS溶液、Na+0.14 M、pH7.4），間接競爭ELISA的IC50值和最低檢測限（IC10值）分別為26.3μg/L和1.4μg/L。與噻蟲啉結(jié)構(gòu)類似物的交叉反應(yīng)率都小于0.1％，可以認(rèn)為沒有交叉反應(yīng)。
　　利用Ph.D.Peptide Display Cloning System構(gòu)建了隨機(jī)展示線性八肽庫。將33-bp的簡并序列連接

3、到M13KE載體上，把連接產(chǎn)物電擊轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞制備噬菌體展示線形八肽庫，TU為8.7×108 pfu/μg，滴度為1.6×1012 pfu/mL。利用生物淘選的方法，從環(huán)形8肽噬菌體庫及線形8肽噬菌體庫中篩選出6種噬菌體展示多肽，并建立了噻蟲啉殘留噬菌體酶聯(lián)免疫分析方法。
　　在最優(yōu)的條件下（5％甲醇PBS溶液、Na+強(qiáng)度0.14M、pH8.5），噬菌體酶聯(lián)免疫分析方法的IC50值為8.3 ug/L，最低檢測限IC10

4、值為0.7μg/L，檢測范圍(IC20-IC80)為1.2-61.1 ug/L。與傳統(tǒng)的ELISA法相比，靈敏度提高3倍以上，與其它結(jié)構(gòu)相似的交叉反應(yīng)率小于0.01％，可以認(rèn)為沒有交叉反應(yīng)。在土壤、梨、番茄、甘藍(lán)樣品中的添加回收率在80.33～116.3％之間，RSD在1.98-9.76％之間，符合農(nóng)藥殘留檢測的標(biāo)準(zhǔn)。噬菌體ELISA的檢測結(jié)果與HPLC的檢測結(jié)果高度一致，兩種檢測方法的相關(guān)性方程為Y=1.0267x+0.0015，R2