利用噬菌體12肽庫(kù)篩選針對(duì)雞IBDV單抗的模擬表位.pdf

1、獨(dú)創(chuàng)性聲明本人聲明所早交的論文是我個(gè)人在導(dǎo)師指導(dǎo)下進(jìn)行的研究T作及取得的研究成果。盡我所知，除了文中特別加以標(biāo)注和致謝的地方外，論文中一i包含其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫過(guò)的研究成果，也彳i包含為獲得安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)或其它教育機(jī)構(gòu)的學(xué)位或證書而使用過(guò)的材料。與我一同丁_作f1勺同志劃本研究所做的任何貢獻(xiàn)均己在論文中作了明確的說(shuō)明并表示了謝意。缸時(shí)間：押)午勿“j關(guān)于論文使用授權(quán)的說(shuō)明本人完仝了解安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定，即：學(xué)校有權(quán)

2、保留送交論文的復(fù)印件和磁盤允許論文被查閱和借閱，可以采用影印、縮印或掃描等復(fù)制手段保存、匯編學(xué)使論文。同意安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)可以用不同方式在不同媒體上發(fā)表、傳播學(xué)位論文n勺全部或部分內(nèi)容。(保密的學(xué)位論文在解密后應(yīng)遵守此協(xié)議)導(dǎo)師簽名：嘲’口J№“月6：1時(shí)間：力。／p年舌月∥Lj摘要lIllImlIIIIIILIII／IIIIIIIIIIllY2149984由傳染性法氏囊炎病毒(Infectiousbursaldiseasevirus，IB

3、DV)引起n7jlBD是雞的一種急性、高度接觸性傳染病。IBDV主要侵害3—12周1出E。／x孤／／雞或青年雞的中樞免疫器官法氏囊，嚴(yán)重感染可導(dǎo)致發(fā)病雞死亡；存活雞則由于法氏囊損傷而造成全身性免疫抑制，結(jié)果因免疫能力下降，易感染其他傳染病。該病呈世界性分布，是危害禽類養(yǎng)殖的三大疫病之一。目前還沒(méi)有特效的藥物治療此病，因此IBDV高效疫苗的研究變得刻不容緩IBDV抗原表位的確立有助于表位疫苗的研究。研究表明，IBDV屬雙RNA病毒科(Bi

4、max，iridaefamilx，)的雙RNA病毒屬(Avanbimax’irus)?；蚪M包括A軍IIB兩個(gè)片段。A片段編碼VP24—3和VP5組成的多聚蛋白；其中VP27FIIVP3為主要結(jié)構(gòu)蛋白，VP4為病毒自身蛋白酶，而VP5只能在IBDV感染的細(xì)胞中被檢測(cè)。B片段編碼VPl蛋白，為RNA依賴的RNA聚合酶。迄今，在IBDVn勺VP2及VP3上發(fā)現(xiàn)多個(gè)抗原表位序列。本研究利用噬菌體肽庫(kù)對(duì)實(shí)驗(yàn)室保存n93株IBDV單克隆抗體(H5

5、3、V1和V38)進(jìn)行生物淘選，淘選出與IBDV單克隆抗體特異性結(jié)合的噬菌體株，進(jìn)而通i立ELISA篩選出能與IBDV競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合IBDV單克隆抗體的噬菌體株，測(cè)序分析其序列后獲得IBDV的抗原表位。具體操作如下：首先：將實(shí)驗(yàn)室保存fl93株IBDV單克隆抗體(H53、V1nv38)細(xì)胞株進(jìn)行復(fù)蘇培養(yǎng)，3株雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清效價(jià)分別為1：256、1：64和1：128。3株雜交瘤細(xì)胞分別注射8周齡1|gBalb／c小鼠腹腔制備腹水，ELIS

6、A沏0定腹水效價(jià)分別達(dá)1：210j，3X1041105以上。H53，V1矛HV38的亞類鑒定均為IgG2b。采用辛酸一飽和硫酸銨法對(duì)3株單克隆抗體提純，純化后的單克隆抗體經(jīng)SDSPAGE出現(xiàn)2條帶，分別為IgG99輕鏈與重鏈。應(yīng)用凝膠分析軟件對(duì)蛋白質(zhì)條帶進(jìn)行光密度掃描，三株單克隆抗體的純度分別為995％，986％H991％。通過(guò)間接ELISA軔19定樣品效價(jià)，達(dá)16X104。經(jīng)處理的單克隆抗體具有較高的純度和活性，能夠保證親和篩選過(guò)程中

7、與噬菌體的特異性結(jié)合。其次，利用噬菌體隨機(jī)12肽庫(kù)對(duì)單克隆抗體H53、V1、V38進(jìn)行4輪淘選，通過(guò)逐輪降低包被濃度及增加洗脫時(shí)間來(lái)提高單克隆抗體與噬菌體的特異性結(jié)合。隨機(jī)挑取30個(gè)噬菌體克隆，通過(guò)噬菌體ELISA鑒定后獲得22個(gè)陽(yáng)性噬菌體克?。贿M(jìn)一步用競(jìng)爭(zhēng)ELISA獲得14個(gè)噬菌體株能抑制單克隆抗體與IBDVIj9結(jié)合，其抑制率達(dá)50％以上。最后，測(cè)定14株噬菌體單克隆寧列。通過(guò)DNAStar軟件分析12肽序列，比對(duì)找出共有序列?？傊?/p>