噬菌體展示肽庫篩選肺癌早期檢測分子標(biāo)志群.pdf

1、背景：目前肺癌缺乏有效的早期診斷、愈后預(yù)測和分子流行病學(xué)研究的分子標(biāo)志,患者血清中存在抗腫瘤自身抗體可能作為肺癌候選標(biāo)志物。 目的：構(gòu)建噬菌體展示肽庫,篩選出肺癌早期檢測的分子標(biāo)志群,確定臨床可以使用的診斷肺癌的分子標(biāo)志。 方法：(1)肺癌噬菌體展示肽庫的構(gòu)建：收集30例上海長海醫(yī)院手術(shù)后立即凍存的肺癌組織標(biāo)本,并經(jīng)病理學(xué)鑒定其組織類型。30例標(biāo)本涵蓋了肺癌的各種組織類型,用傳統(tǒng)的Trizol方法分別抽取了30例肺癌組織

2、標(biāo)本的總RNA,并通過紫外分光光度計(jì)定量、計(jì)算其純度和用瓊脂糖凝膠電泳證實(shí)其完整性,30例標(biāo)本的總RNA均完整可用。根據(jù)OD值定量,我們將30例肺癌組織的總RNA等量混合后,用mRNA提取試劑盒利用結(jié)合poly(A)的磁珠提取mRNA,并經(jīng)過紫外分光光度計(jì)測定其濃度和瓊脂糖凝膠電泳證實(shí)其完整性。mRNA用OrientExpression cDNA和Cloning System兩個(gè)試劑盒經(jīng)反轉(zhuǎn)錄、末端平齊、片段長短篩選、加接頭、雙酶切、連

3、接入載體的雙臂、體外包裝這些步驟成功地構(gòu)建成肺癌噬菌體展示肽庫。其中為了能同時(shí)更好的擴(kuò)增N端和C端的氨基酸,我們使用了隨機(jī)引物作為反轉(zhuǎn)錄的引物。加入0.2體積的80％甘油分別保存與-80℃和4℃冰箱。(2)肺癌特異性的相關(guān)肽的富集：為了富集可以和肺癌自身抗體相結(jié)合的特異的展示肽我們進(jìn)行了正反向的5輪親和篩選。取10μl結(jié)合protein-A/G的瓊脂糖珠于一1.5 ml Eppendorf管中,分別與15μl肺癌組患者及對照組患者的血漿

4、4℃孵育過夜富集抗體。10管肺癌組的抗體及10管對照組的抗體各自合并成一管。取噬菌體庫擴(kuò)增液20μl,先與20μl的對照組抗體孵育1小時(shí),未結(jié)合的上清再與20μl肺癌組抗體結(jié)合,保留結(jié)合到瓊脂糖珠上的噬菌體,并洗脫至100μl擴(kuò)增。此為一輪篩選,如此反復(fù)五輪。(3)肺癌特異標(biāo)志物的篩選：為了找到明確的并且可以在臨床實(shí)際應(yīng)用的肺癌特異標(biāo)志物,我們隨機(jī)挑取了五輪篩選后的2812個(gè)噬菌體克隆用ELISA的方法,進(jìn)行了進(jìn)一步的篩選。1:1000

5、稀釋的T7 tailer抗體包被于96孔酶標(biāo)板,經(jīng)封閉、加噬菌體液、加血漿、加HRP耦聯(lián)的山羊抗人IgG、顯色劑、終止液等主要步驟后在酶標(biāo)儀450nm波長下讀取OD值。每次試驗(yàn)均設(shè)兩孔沒有插入片段的噬菌體作為陰性對照,并設(shè)兩個(gè)不加血漿的孔作為空白對照。按下列公式計(jì)算并判斷結(jié)果：用空白孔調(diào)零后,樣品OD值/陰性對照平均OD值,比值≥2.0,判斷為陽性；樣品OD值/陰性對照平均OD值,比值<2.0,判斷為陰性。陰性對照OD值低于0.05作0

6、.05計(jì)算,高于0.05按實(shí)際OD值計(jì)算。肺癌組為陽性、非肺癌為陰性的噬菌體即為有意義的、具有診斷肺癌潛能的樣本。(4)測序和蛋白功能預(yù)測:ELISA篩選出的噬菌體克隆,測序后經(jīng)過NCBI上的BLAST序列比對找到完全一致或者最接近的已知基因序列,推測我們獲得的基因的是否與癌癥相關(guān)。 結(jié)果：(1)構(gòu)建的肺癌噬菌體展示肽庫的滴度為3.0×106 pfu,隨機(jī)挑選20個(gè)噬菌斑經(jīng)PCR鑒定其重組率為60％。(2)ELISA共篩選出20