隨機(jī)噬菌體12肽庫篩選宮頸癌患者血清腫瘤標(biāo)志物的初步研究.pdf

1、背景：宮頸癌在發(fā)展中國家上升為第2位女性常見的惡性腫瘤，僅次于乳腺癌。據(jù)世界衛(wèi)生組織估計(jì)，在宮頸癌每年新發(fā)病例數(shù)中，中國約占世界總發(fā)病數(shù)的28％。已嚴(yán)重威脅中國女性健康，造成社會(huì)的重大負(fù)擔(dān)。但宮頸癌早期發(fā)現(xiàn)后及時(shí)治療效果顯著、預(yù)后良好。有文獻(xiàn)報(bào)道早期宮頸癌的5年生存率可達(dá)92％，因此宮頸癌的早發(fā)現(xiàn)、早期診斷和治療是非常重要的。目前宮頸癌的診斷方法包括傳統(tǒng)的宮頸涂片細(xì)胞學(xué)檢查、陰道鏡檢查和組織學(xué)檢查。一定程度上提高了宮頸癌在早期的診斷，但

2、這些方法依然仍有各自的缺陷，如巴氏涂片檢查靈敏度低，陰道鏡檢查難以檢查到細(xì)小的病灶，組織活檢的依從性差等。近年血清腫瘤標(biāo)志物如糖鏈抗原199(CA199)、鱗狀上皮細(xì)胞癌抗原(SCC-Ag)、血清糖類抗原125(CA125)、癌胚抗原(CEA)已作為宮頸癌的輔助檢測項(xiàng)目，但其總的靈敏度和特異度并不高。所以尋找一種針對(duì)早期宮頸癌其靈敏度和特異度都高的血清腫瘤標(biāo)志物非常重要。Smith發(fā)明的噬菌體展示技術(shù)(PDT)對(duì)尋找腫瘤血清標(biāo)志物提供了

3、條件，本研究利用PDT，以早期宮頸癌患者血清為靶分子，可能篩選出與宮頸癌患者血清特異性結(jié)合的短肽。
　　目的：用隨機(jī)噬菌體12肽庫對(duì)宮頸癌患者血清進(jìn)行三輪差異性淘選，找出能與宮頸癌患者血清特異性結(jié)合的陽性噬茵體株，通過擴(kuò)大樣本和與不同種類的腫瘤患者血清進(jìn)行再鑒定，挑出與早期宮頸癌患者血清特異結(jié)合且親和力最高的噬菌體株，將其提取單鏈DNA后進(jìn)行測序得到相應(yīng)短肽，為宮頸癌的早期診斷提供新的腫瘤標(biāo)志物，為進(jìn)一步尋找宮頸癌相關(guān)腫瘤標(biāo)志物奠

4、定了基礎(chǔ)。
　　方法：1.采取6例正常人血清及6例早期宮頸癌患者新鮮血清分別混合包被在96孔酶標(biāo)板中（兩孔正常人血清，一孔宮頸癌患者血清），進(jìn)行三輪差異性篩選，每輪都先將噬菌體肽庫與前兩孔正常人血清結(jié)合，再將剩余未結(jié)合噬菌體移至第三孔與早期宮頸癌患者血清結(jié)合，結(jié)合后用洗脫液洗脫第三孔與早期宮頸癌患者血清結(jié)合的噬菌體，并對(duì)其進(jìn)行擴(kuò)增，通過三輪的篩選與擴(kuò)增，與早期宮頸癌患者血清親和力高的噬菌體得到富集，得到特異性結(jié)合的陽性噬菌體。2.

5、用最后一輪篩選所得的噬菌體劃板培養(yǎng)。在每塊板上選取多個(gè)相對(duì)距離較遠(yuǎn)的單克隆噬菌體株，對(duì)其擴(kuò)增，然后用篩選時(shí)的6例正常人血清及6例早期宮頸癌患者血清用ELISA法檢測所選取的各單克隆噬菌體株與早期宮頸癌患者血清的親和力，選取出顏色穩(wěn)定且差別明顯的幾株陽性噬菌體。3.再擴(kuò)大樣本含量檢測所篩選出的噬菌體對(duì)早期宮頸癌患者血清的親和力，挑選出與早期宮頸癌患者血清結(jié)合親和力最好的噬菌體株。4.對(duì)挑選出的陽性噬菌體株提取其單鏈DNA進(jìn)行測序，再根據(jù)遺

6、傳密碼表得到相應(yīng)的短肽。
　　結(jié)果：通過三輪篩選，與宮頸癌患者血清結(jié)合的噬菌體富集率逐輪提高，提高近100倍。挑取單個(gè)噬菌體株后經(jīng)反復(fù)ELISA驗(yàn)證后得到特異性較好的7號(hào)噬菌體株。7號(hào)噬菌體克隆行ELISA檢測6例正常人血清及6例宮頸癌患者血清，結(jié)果顯示正常人組OD值為0.056±0.010，宮頸癌組為0.151±0.040，P＜0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;7號(hào)噬菌體克隆行ELISA檢測50例正常人血清及50例宮頸癌患者血清，結(jié)果

7、顯示正常人組OD值為0.070±0.023，宮頸癌組為0.157±0.040，P＜0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;ELISA驗(yàn)證7號(hào)噬菌體克隆分別與8例宮頸癌患者血清、8例CIN患者血清、8例卵巢癌患者血清及8例正常人血清行ELISA檢測，結(jié)果顯示宮頸癌患者組OD值為0.174±0.018，卵巢癌組為0.052±0.007，CIN組為0.076±0.010，正常人組為0.052±0.006，宮頸癌組與其他組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。分析7號(hào)噬菌體R

8、OC曲線下面積為0.956，P＜0.0001，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，ROC曲線下面積95％的可信區(qū)間為[0.896，0.987]; Medcalc軟件分析其特異度為94％及敏感性為84％;7號(hào)噬菌體測序結(jié)果為:5'-ATG CAC CGG ACG CGT CAGCGA ACC ATT CGT AGC CGA-3'，氨基酸序歹為:SATNGSLTRPVH。7號(hào)噬菌體克隆的DNA序列與鼠類、人類行同源核酸比對(duì)，未見其同源序列;將7號(hào)噬菌體克隆的氨基