大腸癌患者血清腫瘤標志物的篩選及其功能研究.pdf

1、大腸癌是最常見的消化道惡性腫瘤，也是全球癌癥相關死亡的第二位主要原因。大腸癌患者的預后與腫瘤的臨床分期關系密切，由于大腸癌患者早期常常無明顯癥狀，大多數大腸癌患者確診時已是晚期，錯過了最佳治療時機，確診后即使行積極的根治性切除術，約60％的患者仍會發(fā)生局部復發(fā)或遠處轉移，嚴重影響患者的預后。在過去的幾年中，由于大腸癌篩查的較廣泛應用和治療模式的改善，大腸癌患者的生存率不斷提高。另一方面，大腸癌的發(fā)病率與生活方式和膳食結構密切相關。隨著人

2、們生活水平的提高，生活方式、飲食結構的改變以及人們預期壽命的增加，大腸癌的發(fā)病率也進一步提高，且有逐漸年輕化的趨勢。及早發(fā)現大腸癌及其癌前病變，并行積極的干預治療，是降低大腸癌發(fā)病率、提高患者生存率、延長患者生存時間的關鍵。因此，大腸癌的早期篩查具有十分重要的意義。
　　目前，大腸癌篩查的主要手段包括高靈敏度的糞便潛血試驗和結腸鏡檢查。糞便潛血試驗檢測性能好、成本低、且病人無痛苦、無損傷性，是目前應用最廣泛的大腸癌篩查方法。但糞便

3、潛血試驗特異性差、敏感性低。在許多其他疾病，如消化性潰瘍、上消化道出血等疾病中，糞便潛血試驗的結果也可能陽性，從而使一些非腫瘤患者最初診治時誤以為是腫瘤，給患者帶來較大心理壓力及后續(xù)繁瑣的檢查，消耗患者大量精力及財力。另一方面，只有當出血量達到一定量時，才能在糞便中檢測到潛血，因此通過糞便潛血試驗陽性檢測出的多為晚期大腸癌患者。
　　結腸鏡檢查是目前大腸癌篩查最有效的手段，是大腸癌診斷的金標準。在美國，由于結腸鏡篩查的逐步應用，5

4、0歲及以上成人大腸癌的發(fā)病率顯著下降。但結腸鏡檢查程序復雜，價格昂貴，且普通結腸鏡檢查病人非常痛苦，有心臟病及凝血功能障礙等疾病的患者不能進行結腸癌檢查，約三分之一的患者由于耐受性差放棄結腸鏡檢查。因此，結腸鏡檢查限制較多，不適合在無癥狀人群中直接開展結腸鏡篩查。
　　血清腫瘤標志物是可用于癌癥患者檢測的一種簡易方法，在臨床上已有較普遍應用。癌胚抗原(CEA)和糖類抗原199(CA199)是目前最常用的大腸癌血清學腫瘤標志物。然而

5、CEA和CA199在許多其他惡性腫瘤患者血清水平也有升高，對大腸癌診斷的特異性不高，且在早期大腸癌診斷中意義有限。開發(fā)、選擇新的高靈敏度和高特異性的大腸癌血清腫瘤標志物具有重大的意義。
　　蛋白質組學是鑒定新的腫瘤標志物或腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中關鍵蛋白的有效方法，在腫瘤標志物的發(fā)掘方面具有重大的意義?？贵w芯片是蛋白芯片的一種，是目前蛋白質組學研究的有效工具。該研究中使用人細胞因子抗體芯片同時檢測274種細胞因子在大腸癌患者與正常對照

6、組人群血清中的表達，為大腸癌早期篩查篩選出新的異常表達蛋白質，并進一步擴大樣本量進行ELISA驗證，從而為大腸癌的早期篩查提供新的腫瘤標志物CEACAM1、Cripto-1、VCAM-1和41BB;通過免疫組織化學的方法進一步研究這些腫瘤標志物在大腸癌組織中的表達及其與臨床病理參數之間的關系，探索其在大腸癌發(fā)生、發(fā)展、預后判斷、靶向治療及療效評估中的意義。
　　研究目的:
　　1、檢測大腸癌患者與正常對照人群血清中蛋白質的表

7、達，篩選出大腸癌患者血清中高表達的蛋白質，為大腸癌的早期篩查提供新的血清學腫瘤標志物。
　　2、檢測大腸癌腫瘤組織及其對應的正常大腸粘膜組織中差異蛋白質的表達情況，分析其與臨床病理參數的關系，探討其在腫瘤發(fā)生、發(fā)展、治療及預后判斷中的意義。
　　材料和方法:
　　1、選取5例大腸癌患者術前血清及正常對照人群血清，應用RayBio公司的人細胞因子抗體芯片G-4000(AAH-CYT-G4000)篩選出大腸癌患者與正常對照

8、人群血清中差異表達的蛋白質。
　　2、選取抗體芯片大腸癌患者血清中差異高表達的蛋白質，擴大樣本量，在30例大腸癌患者血清中進行ELISA驗證及統(tǒng)計學分析，分析其在大腸癌早期診斷中的價值，篩選出大腸癌早期診斷新的血清學腫瘤標志物。
　　3、應用免疫組織化學染色的方法檢測大腸癌及其對應正常大腸粘膜石蠟組織中差異蛋白質的表達，分析其與臨床病理參數的關系，探討其在大腸癌發(fā)生、發(fā)展、治療以及預后判斷中的意義，為大腸癌靶向治療及預后判斷

9、提供新的生物學靶點。
　　結果:
　　1、AAH-CYT-G4000抗體芯片檢測274種蛋白質在大腸癌患者及正常對照人群血清中的表達，以P＜0.05定義為差異具有統(tǒng)計學意義。并計算各細胞因子的倍數改變以顯示它們的相對表達水平，任何倍數改變≥1.5或≤1/1.5的信號強度認為有重大意義。蛋白芯片結果顯示大腸癌患者及正常對照人群血清中有94種蛋白質差異表達，其中有66種蛋白質在大腸癌患者血清明顯高表達，包括AFP、IL-17R、

10、Cripto-1、CA199、CALCA、DKK-4、TG、CEACAM1、CEA、41BB、HER2/ErbB2、CDH1、IL-17F、Ubiquitin、NGF R、ANGPTL4、Angiostatin、CCL14、TGF beta2、CA9、BMP-5、CTSS、GDF-15、FSH、CD23、S-100b、TRAIL R2、VCAM-1, CA125, DKK-1, IP-10, beta2 M, MDC, DR6(TNFR

11、SF21), Fas Ligand,LIF、Shh N、IL-2 Rbeta、TIMP-4、CRP、Adiposin, sgp130、hCG intact、HVEM、CA15-3、BMP-7、IL-13 R alpha1、LYVE-1、MMP-9、TNF-beta、IL-9、NAP-2、MIP-1 delta、ErbB3、PSA-free、IL-6、IL-18 Bpalpha、CD40 Ligand、NID1、IL-3、IL-1alph

12、a、CXCL-16、Angiogenin、ALCAM、FSTN、BCAM。28種蛋白質在大腸癌患者血清明顯低表達，包括IGFBP-2、VEGF R3、Insulin、Resistin、PDGFRbeta、VEGF R2、TREM-1、SCF R、TIMP-2、CD30、PDGF-BB、ICAM-2、Osteoprotegerin、PSA-total、TSH-β、Upar、Stnf RⅡ、EGF-R、MMP-3、L-Selectin、Si

13、l-6 R、MICB、E-Selectin, Axl, HCC-4, TRAIL R3, Stnf-RI, MSP-alpha。
　　2、ELISA驗證大腸癌患者血清差異表達蛋白質，結果顯示大腸癌患者血清中CEACAM1、Cripto-1、VCAM-1和41BB蛋白水平明顯高于正常對照人群，這4種蛋白質在大腸癌診斷中的價值均大于0.7，具有較高的敏感性及特異性，可以作為大腸癌篩查新的血清學腫瘤標志物。
　　3、免疫組織化學驗

14、證CEACAM1、Cripto-1、VCAM-1和41BB在大腸癌組織中的表達。結果顯示CEACAM1、Cripto-1、VCAM-1和41BB在大腸癌腫瘤細胞中均呈陽性高表達。CEACAM1、Cripto-1、VCAM-1和41BB的高表達與臨床分期相關，CEACAM1、Cripto-1和VCAM-1的高表達與淋巴結轉移相關。
　　結論:
　　1、抗體芯片可以同時、高效地檢測多種蛋白質在腫瘤患者血清中的表達，是一種較好的腫

15、瘤標志物篩選手段。
　　2、CEACAM1、Cripto-1、VCAM-1和41BB在大腸癌患者血清中高表達，檢測血清中CEACAM1、Cripto-1、VCAM-1和41BB水平有助于早期、無創(chuàng)地發(fā)現大腸癌患者，可以作為大腸癌早期篩查新的血清學腫瘤標志物。
　　3、CEACAM1、Cripto-1、VCAM-1和41BB在大腸癌腫瘤組織中高表達，且與腫瘤的臨床分期及淋巴結轉移相關，檢測大腸癌腫瘤組織中CEACAM1、Cri

16、pto-1、VCAM-1和41BB的表達有助于判斷大腸癌患者的預后，并可能成為大腸癌患者靶向治療的新靶點。
　　本研究的創(chuàng)新之處:
　　1、應用AAH-CYT-G4000抗體芯片同時檢測大腸癌患者與正常對照人群血清中274種細胞因子的表達，為大腸癌早期篩查提供新的血清學腫瘤標志物，通過擴大樣本量進行ELISA驗證及統(tǒng)計學分析，篩選出大腸癌新的血清學腫瘤標志物CEACAM1、Cripto-1、VCAM-1和41BB，為大腸癌早