大腸癌血清腫瘤標記物平行檢測液相芯片的研制.pdf

1、結(jié)直腸癌是消化道常見的惡性腫瘤，病因尚未十分明確。全球結(jié)直腸癌每年發(fā)病新病例數(shù)達94萬，每年近50萬人死于結(jié)直腸癌。結(jié)直腸癌死亡居癌癥死因第3位。結(jié)直腸癌在我國也是最常見的惡性腫瘤之一，目前居惡性腫瘤發(fā)病率第4位。目前早期發(fā)現(xiàn)及診斷結(jié)直腸癌的主要方法是纖維內(nèi)鏡檢查，大便潛血、直腸指檢與直腸鏡結(jié)合，以提高直腸癌的早期診斷率，但是目前還沒有一種更好的無創(chuàng)的早期診斷的血液診斷指標。腫瘤標記物作為結(jié)直腸癌的輔助診斷指標已經(jīng)應用于臨床，但是需要逐

2、項去做，給臨床檢測帶來較多的麻煩，同時試驗成本也高，因此非常有必要研究開發(fā)一種可以同時檢測多種腫瘤標記物的診斷技術(shù)，2000年誕生的生物芯片技術(shù)之高通量、平行檢測的優(yōu)勢能滿足這一需要。 目的 本課題選用臨床上正在應用的血清標志物癌胚抗原(CEA)、糖鏈抗原199(CA199)、糖鏈抗原242(CA242)作為靶蛋白，采用一次可準確可靠測定多種靶分子的Luminex多色微球檢測技術(shù)，研發(fā)可直接檢測結(jié)直腸癌的血清標記物的液相

3、芯片檢測系統(tǒng)，即可做到正確的診斷結(jié)直腸癌，又能方便快捷，一次檢測多個標記物，避免常規(guī)ELISA的繁瑣，和接觸有害物質(zhì)的弱點，節(jié)約成本。 方法 1．CEA、CA199、CA242配對抗體的選擇，包括用于結(jié)合腫瘤標記物的捕獲抗體，和用于檢測腫瘤標記物的濃度的檢測抗體，兩個抗體必須是識別待測腫瘤標記物的不同位點。 2．微球的選擇：由于要檢測的目標是蛋白質(zhì)，因此選擇羧基微球，可以與蛋白質(zhì)的氨基結(jié)合，從而達到偶聯(lián)的目的。

4、 3．CEA、CA199、CA242檢測抗體的生物素化：按照參考文獻的方法進行，偶聯(lián)后進行透析及柱純化。 4．CEA、CA199、CA242的捕獲抗體與微球的偶聯(lián)：分別選用羧基微球5號、35號和79號，利用微球所含有的羧基分別與CEA捕獲抗體、CA199捕獲抗體和CA242捕獲抗體中的的蛋白質(zhì)分子中的氨基反應形成共價偶聯(lián)，成為可捕獲目的蛋白的靶分子。 5．包被好的微球與血清反應時間的優(yōu)化：采用L<,9>(3<'4>

5、)正交法。 6．生物化的CEA、CA199、CA242檢測抗體反應濃度以及反應時間的優(yōu)化：采用L<,9>(3<'4>)正交法。 7．SA-R-PE反應濃度及反應時間的優(yōu)化采用L<,9>(3<'4>)正交法。 8．標準曲線的擬合及可信限的確定：不同的標準腫瘤標記物的濃度范圍不同根，標準品的濃度和標準曲線的擬合情況，確定測量的可信限范圍。 9．Cutoff值的確定：通過查閱文獻以及正常人與病人的樣本的檢測確定

6、cutoff值，并進行腫瘤標記物液相芯片系統(tǒng)靈敏度、特異度評價。 10．芯片的重復性和穩(wěn)定性實驗：根據(jù)上述結(jié)果制備可同時檢測3種腫瘤標記物的液相芯片，并對芯片的重復性和穩(wěn)定性進行檢測。 11．大腸癌腫瘤標記物平行檢測液相芯片的應用及其與傳統(tǒng)方法的比較及評價：應用研制的液相芯片對55例臨床標本進行檢測，并與酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)的檢測結(jié)果比較，SPSS統(tǒng)計分析軟件分析檢測結(jié)果。 結(jié)果 1． CEA、

7、CA199、CA242配對抗體的選擇配對抗體經(jīng)過查閱資料，選擇從公司購買，包括：CEA捕獲抗體、CEA檢測抗體；CA199捕獲抗體、CA199檢測抗體；CA242包被抗體、CA242檢測抗體。 2．羧基微球的選擇根據(jù)公司的推薦及查閱資料選擇5號、35號和79號微球 3．用ELISA的方法檢驗生物素化的抗體，經(jīng)卡方檢驗，與商業(yè)化的抗體相比沒有統(tǒng)計統(tǒng)計學差異。 4．微球包被好，用血細胞計數(shù)器計數(shù)微球的濃度，5號微球濃

8、度1.5×10<'6>個/ml，35號微球濃度1.1×10<'6>個/ml，79號微球濃度1.3×10<'6>個/ml。 5．標記物的捕獲抗體與微球的偶聯(lián)效果：將包被好的微球運用Luminex系統(tǒng)檢測偶聯(lián)效果： 包被CEA抗體的5號羧基微球平均熒光強度為18853.5，5號空白羧基微球平均熒光強度為82；包被CAl99抗體的35號羧基微球平均熒光強度為12500，35號空白羧基微球平均熒光強度為35；包被CA242抗體的

9、79號羧基微球平均熒光強度為17019.5，79號空白羧基微球平均熒光強度為75。 6．包被好的微球與血清反應時間的優(yōu)化：最優(yōu)反應時間1小時。 7．生物化的CEA、CA199、CA242抗體反應濃度以及反應時間的優(yōu)化：最優(yōu)反應濃度為1:300稀釋，最優(yōu)反應時間1小時。 8． SA-R-PE反應濃度及反應時間的優(yōu)化：最優(yōu)反應濃度為12μg/ml，最優(yōu)反應時間30分鐘。 9．根據(jù)標準品的濃度和標準曲線的擬合情

10、況，確定測量CEA、CA199和CA242可信限范圍分別為150ng/ml、150U/ml和240U/ml。 10．通過查閱文獻以及樣本的檢測確定CEA、CA199和CA242cutoff值分別為8ng/ml、37U/ml和20U/ml。 芯片的重復性和穩(wěn)定性實驗根據(jù)上述結(jié)果制備可同時檢測3種腫瘤標記物的芯片，并對芯片的重復性和穩(wěn)定性進行檢測：經(jīng)卡方檢驗，對同一標本進行連續(xù)檢測，結(jié)果無顯著性差異。最后優(yōu)化的條件為：

11、 ①待檢血清與500個包被好的微球反應1小時。 ②洗滌3次，每次2min。 ③加入1:300稀釋好的生物素化的CEA、CA199和CA242檢測抗體，反應1小時。 ④洗滌3次，每次2min。 ⑤按濃度12μg/ml加入SA-R-PE，反應時間30min。 ⑥luminex100檢測：全程的實驗時間大約2.5小時完成，大大的縮短了試驗時間，較目前采用的方法簡便快速，而且有高通量的特點。 1

12、1．對55份臨床血清分別用液相芯片和ELISA方法進行檢測，發(fā)現(xiàn)兩種檢測方法檢測結(jié)果無統(tǒng)計學差異(p>0.05)。 結(jié)論 建立了基于抗原抗體反應的液相蛋白芯片系統(tǒng)，并且制備了能同時檢測3種大腸癌腫瘤標記物的液相蛋白芯片，并優(yōu)化出了最佳反應條件。將目前對腫瘤標記物的單個檢測到多種標記物的平行檢測的目的，具有樣本用量少、節(jié)約時間、操作簡便、價格低廉等優(yōu)點。該方法具有較強的臨床檢測使用價值，為進一步開發(fā)更多腫瘤標記物平行檢測的