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文檔簡介
1、腫瘤標(biāo)志物在腫瘤的臨床診斷和治療中占有重要地位,不僅可用于腫瘤普查、早期診斷、輔助診斷、良惡性鑒別和臨床分期,同時(shí)對(duì)監(jiān)測療效、判斷預(yù)后、預(yù)測腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移也具有重要價(jià)值。臨床上常采用多種腫瘤標(biāo)志物聯(lián)合檢測,應(yīng)用多變量分析的方法來提高腫瘤診斷的陽性率和特異性。目前常用的血清腫瘤標(biāo)志物檢測方法包括放射免疫測定(RIA)、酶聯(lián)免疫測定(ELISA)、化學(xué)發(fā)光免疫測定(CLIA)、時(shí)間分辨熒光免疫測定(TRFIA)等,這些方法存在一個(gè)共同的局
2、限性——每次僅能檢測一種腫瘤標(biāo)志物,因此檢測多項(xiàng)指標(biāo)時(shí)不僅將增加被檢測者的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān),也使檢測者耗費(fèi)更多時(shí)間、精力和試劑。 液相芯片是基于美國Luminex公司xMAP(flexible Multi—Analyte Profiling)技術(shù)的新型生物芯片技術(shù)平臺(tái),它是在不同熒光編碼的微球上進(jìn)行抗原.抗體、酶一底物、配體.受體的結(jié)合反應(yīng)及核酸雜交反應(yīng),通過紅、綠兩束激光分別檢測微球編碼和報(bào)告熒光信號(hào)來達(dá)到定性和定量的目的,一個(gè)反應(yīng)孔
3、內(nèi)可以完成多達(dá)100種不同的生物學(xué)反應(yīng),是一種新一代高通量分子診斷技術(shù)平臺(tái)。與其它免疫分析方法相比,液相芯片技術(shù)除了具有快速、靈敏、靈活、檢測范圍廣等顯著特點(diǎn),其最突出優(yōu)勢還在于可以同時(shí)對(duì)同一樣本中多種不同的目的分子進(jìn)行定性和定量分析。 鑒于臨床上聯(lián)合分析多種腫瘤標(biāo)志物的必要性以及目前檢測手段的局限性,我們的研究目的是應(yīng)用液相芯片技術(shù)開發(fā)出能夠聯(lián)合檢測多種血清腫瘤標(biāo)志物的新型免疫診斷試劑。 我們選擇了數(shù)種臨床上常用的腫瘤
4、標(biāo)志物——癌胚抗原(CEA)、甲胎蛋白(AFP)、總前列腺特異性抗原(tPSA)、神經(jīng)原特異性烯醇化酶(NSE)以及乙肝表面抗原(ItBsAg)為待測物,根據(jù)雙抗體夾心免疫分析原理研制了能同時(shí)定量測定其中3~4項(xiàng)指標(biāo)(即CEA+AFP+HBsAg、CEA+AFP+tPSA、CEA+AFP+tPSA+NSE)的液相芯片檢測試劑,評(píng)價(jià)了試劑的檢測范圍、最低檢測限、精密度、正常參考值范圍、穩(wěn)定性、靈敏度、特異度、準(zhǔn)確度等,并與化學(xué)發(fā)光免疫分析
5、法(CLIA)和時(shí)間分辨熒光免疫分析法(TRFIA)進(jìn)行了臨床血清標(biāo)本檢測結(jié)果的相關(guān)性比較。 結(jié)果顯示: (1)、CEA+AFP+tBsAg:檢測范圍分別為0.016~400 ng/ml、0.013~166.4 ng/ml、0.26~1625 ng/ml:最低檢測限分別為10.7 pg/ml、13.3 pg/ml、0.26ng/ml;批內(nèi)精密度<9﹪,批間精密度<14﹪:測定100份臨床血清標(biāo)本的靈敏度為92﹪~98.2
6、﹪,特異度為95.5﹪~100﹪,準(zhǔn)確度為96﹪~97﹪;與CLIA測值的相關(guān)系數(shù)分別為0.936、0.962(指CEA、AFP,n=100),與TRFIA的相關(guān)系數(shù)分別為0.937、0.972、0.918(n=100)。 (2)、CEA+AFP+tPSA(兩步法):檢測范圍分別為0.031~400 ng/ml、0.026~166.4ng/ml、0.008~40 ng/ml;最低檢測限分別為31.3 pg/ml、13.0 pg/
7、ml、5.2 pg/ml;批內(nèi)精密度<10﹪,批間精密度<14﹪;測定100(109)份臨床血清標(biāo)本的靈敏度為96.2﹪~98.2﹪,特異度為97.7﹪~98.2﹪,準(zhǔn)確度為97﹪~98﹪;與CLIA測值的相關(guān)系數(shù)分別為0.961、0.972(n=100)、0.962(n=109),與TRFIA的相關(guān)系數(shù)分別為0.958、0.980(n=100)、0.955(n=109)。 (3)、CEA+AFP+tPSA+NSE:檢測范圍分別為0.0
8、39~400 ng/ml、O.030~121 ng/ml、0.007~30 ng/ml、0.146~300 ng/ml;最低檢測限分別為26.0 pg/ml、19.7 pg/ml、4.9 pg/ml、73.2 pg/ml;批內(nèi)精密度<9﹪,批間精密度<13﹪:與CLIA測值的相關(guān)系數(shù)分別為0.986、0.979(n=64)、0.964(n=60)、0.958(n=64)。 (4)、CEA+AFP+tPSA(一步法):檢測范圍分別
9、為0.031~400 ng/ml、O.052~200ng/ml、0.016~60 ng/ml;最低檢測限分別為31.3 pg/ml、26.0 pg/ml、7.8 pg/ml;批內(nèi)精密度<10﹪,批間精密度<14﹪;與CLIA測值的相關(guān)系數(shù)分別為0.920、0.923(n=30)、0.940(n=41);與分步反應(yīng)法的相關(guān)系數(shù)分別為0.963、0.952(n=30)、0.979(n=41)。 (5)、穩(wěn)定性:將液相芯片試劑的主要組
10、分——CEA抗體交聯(lián)微球、抗原標(biāo)準(zhǔn)品和生物素標(biāo)記抗體于37℃放置7天后,標(biāo)準(zhǔn)品熒光值有所下降,但標(biāo)準(zhǔn)曲線良好,檢測范圍無改變,3個(gè)陽性血清的測值與放置前接近,批內(nèi)和批間CV仍低于10﹪。 我們的研究結(jié)果證明,液相芯片檢測試劑可在2~3 h內(nèi)聯(lián)合定量測定1~2 μl人血清中的CEA、AFP、HBsAg、tPSA、NSE水平,該試劑操作簡單、快速、靈活、靈敏度高(達(dá)到pg級(jí))、重復(fù)性好(CV<14﹪)、檢測范圍廣(3~5個(gè)數(shù)量級(jí)),
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