懸浮芯片聯(lián)合高效液相色譜檢測(cè)乳腺癌血清標(biāo)志物的研究.pdf

1、背景
　　 乳腺癌是全世界女性最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一,嚴(yán)重威脅女性的身心健康。傘世界乳腺癌的發(fā)病率一直呈穩(wěn)步上升的趨勢(shì),20世紀(jì)末的統(tǒng)計(jì)資料表明世界每年約有115萬(wàn)人診斷為乳腺癌,有41萬(wàn)人死于該病,發(fā)病年齡也有年輕化趨勢(shì),是導(dǎo)致女性腫瘤患者死亡的第一大因?yàn)椤Ｈ欢?乳腺癌的病因尚不十分清楚,其發(fā)病機(jī)制也非常復(fù)雜,影響發(fā)病的因素很多。近年來(lái),隨著腫瘤分子病理學(xué)和分 子生物學(xué)研究的深入,人們認(rèn)識(shí)到腫瘤的發(fā)生和發(fā)展是一個(gè)多階段、多基因改

2、變參與的漸進(jìn)過(guò)程。多個(gè)癌基因的異常激活和編碼蛋白的過(guò)度表達(dá)以及抑癌基因的缺失、突變失活導(dǎo)致細(xì)胞增殖失控而惡性轉(zhuǎn)化,可能是腫瘤發(fā)生的分子生物學(xué)基礎(chǔ)。隨著新的治療理念的提出和綜合治療的實(shí)施,乳腺癌的治療水平不斷提高,總生存率也在逐漸提高,但復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移仍是乳腺癌治療失敗和死亡的主要因?yàn)?因此研究乳腺癌生物學(xué)行為,尋找治療敏感性相關(guān)生物學(xué)標(biāo)志物將有助于臨床工作。HIF-1α和Her-2是乳腺癌兩個(gè)獨(dú)立的預(yù)后因子,對(duì)乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移有重要

3、影響,在乳腺癌中的生物學(xué)作用以及作為提示乳腺癌預(yù)后因素和針對(duì)其研制特異性的單克隆抗體來(lái)治療乳腺癌日益成為近年來(lái)乳腺癌研究的熱點(diǎn)。但以往國(guó)內(nèi)外研究多見(jiàn)于免疫組化對(duì)乳腺癌的研究,免疫組化研究操作比較復(fù)雜、耗時(shí)、費(fèi)力,而且不能對(duì)患者進(jìn)行實(shí)時(shí)、動(dòng)態(tài)檢測(cè)病情變化,目前對(duì)HIF-1α和Her-2ECD在乳腺癌血清中的聯(lián)合定量檢測(cè)尚無(wú)相關(guān)報(bào)導(dǎo)。甘氨酸、丙氨酸作為腫瘤細(xì)胞重要的合成原料和代謝產(chǎn)物,受HIF-1α通道調(diào)控,在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸都有舉足

4、輕重的作用,但相關(guān)研究亦未見(jiàn)報(bào)道,故尋找一種新的檢測(cè)方法,定量分析人體代謝途徑中相關(guān)的腫瘤標(biāo)志物,盡可能提高腫痛標(biāo)志物的檢出率是非常重要的。本課題利用懸浮芯片技術(shù)聯(lián)合高效液相色譜定量檢測(cè)乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌患者血清中HIF-1α、Her-2ECD、Ala和Gly含量變化規(guī)律,分析其內(nèi)在的相關(guān)性及其與乳腺癌臨床病理、生物學(xué)特性的關(guān)系；探討HIF-1α、Her-2ECD、Ala和Gly在乳腺癌診斷和監(jiān)測(cè)病情的作用,以及評(píng)估其對(duì)乳腺癌診斷的價(jià)值。

5、
　　 目的
　　 本研究擬從乳腺癌患者機(jī)體的代謝途徑尋找動(dòng)態(tài)的腫瘤標(biāo)志物,探討他們之間內(nèi)在相關(guān)性。研究采用懸浮芯片聯(lián)合高效液相色譜技術(shù),分析HIF-1α、Her-2ECD、甘氨酸和丙氨酸的含量變化,及其與臨床病理因素和預(yù)后的關(guān)系,并進(jìn)一步探索HIF－1α、HER-2ECD、Ala和Gly在乳腺癌診斷、預(yù)后評(píng)估和療效評(píng)價(jià)中的價(jià)值和意義。
　　 方法
　　 1.病例來(lái)源 選自寧波大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院乳腺外科2

6、006～2008年住院病人,其中乳腺原發(fā)浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌117例,術(shù)后復(fù)發(fā)乳腺浸潤(rùn)導(dǎo)管痛10例,乳腺良性腫瘤20例,體檢健康擬行乳腺美容手術(shù)31例(正常對(duì)照)。乳腺原發(fā)浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌術(shù)前均未進(jìn)行相關(guān)放療、化療、內(nèi)分泌治療及免疫治療。
　　 2.血清標(biāo)木采集 所有入選對(duì)象在清晨空腹采肘正中靜脈血10ml,靜置120分鐘,3000r/min離心20分鐘取血清,編號(hào),-80℃冰箱保存,待檢(根據(jù)術(shù)后的病理結(jié)果篩選保存的乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌和良性

7、腫瘤及乳腺美容患者血清標(biāo)本冷藏待檢)。
　　 3.組織標(biāo)本的采集 術(shù)中將手術(shù)切除的惡性腫瘤或良性腫瘤標(biāo)本切取無(wú)壞死的瘤組織各約1g,以及在行乳腺美容手術(shù)時(shí)切取正常組織約1g,然后用冰鹽水沖洗除掉血污,立即置入液氮中,保存于-80℃低溫冰箱。檢測(cè)前分別取少許腫瘤組織,稱重后用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.9％的冰冷生理鹽水按150mg:1.5ml的比例在冰浴下超聲粉碎制成10％的腫瘤組織勻漿,以4000r/min(離心半徑8cm)離心10min,

8、取上清液冷藏保存待檢測(cè)。
　　 4.檢測(cè)方法 血清HIF-1α和Her-2ECD含量采用懸浮芯片試劑盒檢測(cè)(檢測(cè)范圍>1pg),并用酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法測(cè)定做對(duì)照(HIF-1α檢測(cè)范圍:10000-156pg;Her-2ECD檢測(cè)范圍:>O.39ng/ml)。血清和組織中甘氨酸和丙氨酸利用高效液相色譜法檢測(cè),利用配套軟件計(jì)算出含量。
　　 5.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS13.0軟件進(jìn)行,所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((x

9、)±s)表示,多組間比較采用方差分析(F檢驗(yàn)),組間兩兩比較采用t檢驗(yàn),P<0.05為差異,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。對(duì)液相芯片法與ELISA或HPLC的檢測(cè)結(jié)果采用Spearson積矩相關(guān)分析,檢驗(yàn)水準(zhǔn),α=0.05。
　　 結(jié)論
　　 1.運(yùn)用懸浮芯片技術(shù)聯(lián)合檢測(cè)血清HIF-1α和Her-2ECD兩種腫瘤標(biāo)志物的含量,與比對(duì)試劑盒比較的相關(guān)性好,實(shí)驗(yàn)結(jié)果可靠,靈敏度高、操作簡(jiǎn)單,對(duì)乳腺癌的診斷和研究具有較高的輔助價(jià)值?？捎糜谂R床

10、檢測(cè)和課題實(shí)驗(yàn)研究。
　　 2.乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌HIF-1α和Her-2ECD水平過(guò)表達(dá),是病人預(yù)后不良的指征,其過(guò)度表達(dá)說(shuō)明它在腫瘤發(fā)生、轉(zhuǎn)化中起重要作用。所以動(dòng)態(tài)檢測(cè)乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌血清HIF-1α和Her-2ECD水平可提供實(shí)時(shí)、動(dòng)態(tài)的信息,為制定治療方案提供幫助。因此檢測(cè)血清HIF-1α和Her-2ECD水平的動(dòng)態(tài)變化對(duì)乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的早期判斷及預(yù)后評(píng)估具有重要意義。
　　 3.Ala和Gly參與了乳