乳腺癌多藥耐藥機(jī)制與標(biāo)志物的初步研究.pdf

1、背景與目的：
　　乳腺癌是一種嚴(yán)重危害女性健康的常見惡性腫瘤。近幾十年來，其發(fā)病率逐年上升。每年全世界約有110多萬人被診斷為乳腺癌，而有約40多萬人死于該病[1]。在歐美國家乳腺癌占女性惡性腫瘤的25％－32%，據(jù)美國癌癥協(xié)會估計，美國每年乳腺癌新發(fā)病例有17萬，死于乳腺癌的人數(shù)為4萬[2]。我國雖不屬于乳腺癌的高發(fā)國家，但我國患者每年平均增長速度卻已經(jīng)高出高發(fā)國家2個百分點左右，最糟糕的情況是而且仍然以每年3％的速度遞增。在中

2、國國內(nèi)許多超大城市里，乳腺癌發(fā)病率已然上升成為女性惡性腫瘤第一位，成為女性健康的最大威脅。有研究顯示，在我國京、津、滬及沿海一些大城市的發(fā)病率較高，上海市的發(fā)病率居全國首位，而目前天津市乳腺癌發(fā)病率位居女性惡性腫瘤發(fā)病的第二位，僅僅是排在肺癌之后，而且年齡性別研究發(fā)病率顯示乳腺癌發(fā)病高峰有年輕化的趨勢。
　　目前手術(shù)、放療、化療仍然是乳腺癌的主要治療手段。輔助化學(xué)治療的使用使早期乳腺癌的生存率提高30%，然而乳腺癌發(fā)生耐藥是臨床上

3、患者治療失敗和死亡的主要原因。腫瘤細(xì)胞根據(jù)其獨有的耐藥特點，可將耐藥表型分為單藥耐藥(Primarydrugresistance, PDR)和多藥耐藥(Multidrug resistance, MDR)兩大類。而多藥耐藥和轉(zhuǎn)移的發(fā)生是無疑是臨床上腫瘤患者治療失敗和死亡的主要原因之一。在過去幾十年中，雖然對惡性腫瘤的這兩種特性已經(jīng)有了很廣泛的研究，但是大多數(shù)只是把其做為兩種單獨的生物學(xué)行為進(jìn)行研究。近來越來越多的研究表明這兩種表型之間的

4、確建立著一種功能上的聯(lián)系：首先是從親本細(xì)胞中篩選出來的耐藥細(xì)胞系具有更強(qiáng)的侵襲和轉(zhuǎn)移能力，此外對一些轉(zhuǎn)移性腫瘤的研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移灶細(xì)胞比原發(fā)瘤的耐藥性明顯增強(qiáng)，而這與臨床上所觀察到的發(fā)生轉(zhuǎn)移的腫瘤患者化療效果較差以及化療效果不好的腫瘤患者容易出現(xiàn)轉(zhuǎn)移的結(jié)果相一致。因此，這種腫瘤細(xì)胞耐藥可以增強(qiáng)其轉(zhuǎn)移能力現(xiàn)象表明，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中，耐藥和轉(zhuǎn)移的進(jìn)展可能不是相互獨立的，兩種現(xiàn)象之間可能有更直接的聯(lián)系。
　　最近一些研究表明獲得多藥耐

5、藥的腫瘤細(xì)胞通常伴有侵襲能力增強(qiáng)的特性。幾種證據(jù)顯示多藥耐藥發(fā)生時其他信號通路的聯(lián)合激活會增加多藥耐藥癌癥細(xì)胞的侵襲潛能。然而，更精確的機(jī)制目前尚不清楚。本研究中，為了更好的理解由耐藥性引起的腫瘤形成的相關(guān)分子通路，建立了長時間培養(yǎng)在表柔比星藥物內(nèi)的P糖蛋白過表達(dá)的人乳腺癌細(xì)胞系SK-BR-3/EPR。SK-BR-3/EPR表現(xiàn)出來增殖活性的降低，但是同時細(xì)胞的侵襲能力增強(qiáng)。同時，可以觀察到與腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)的基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP-2/9

6、）在SK-BR-3/EPR細(xì)胞中的表達(dá)升高。另外，SK-BR-3/EPR細(xì)胞中STAT3的活性也提高了。STAT3信號通路的激活上調(diào)了MMP-2/9的表達(dá)，從而進(jìn)一步增強(qiáng)了SK-BR-3/EPR細(xì)胞的侵襲能力。STAT3是眾所周知的癌癥基因，經(jīng)常會參與到腫瘤發(fā)生形成和對化療具有抗藥性等的過程中。本研究深入探討了潛在的多藥耐藥和腫瘤侵襲功能聯(lián)系的機(jī)制。
　　如上所述，乳腺癌的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移是造成乳腺癌預(yù)后不良的主要原因，1/3乳腺癌患者五

7、年之內(nèi)會出現(xiàn)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移或者病死，如果能盡早發(fā)現(xiàn)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移灶采取及時的治療，仍然可以是一部分患者獲得較好的療效，延長患者生存期。乳腺癌的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移是一種非常復(fù)雜的機(jī)制，有很多因素調(diào)控，第一部分的研究也部分的討論了乳腺癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移和多藥耐藥之間的聯(lián)系，通過查閱乳腺癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移機(jī)制文獻(xiàn)，作者發(fā)現(xiàn)人附睪蛋白4(HE4)是近年來用于卵巢癌早期篩查的腫瘤標(biāo)志物，有研究證實HE4在乳腺癌中也有表達(dá)，但是其在乳腺癌中的具體作用和機(jī)制研究較少。
　　人附睪蛋

8、白4（HE4）是新型的腫瘤標(biāo)記物，在檢測卵巢癌時有很高的靈敏度和特異度。在婦科盆腔腫瘤疾病中診斷中有優(yōu)勢，美國食品藥品管理局（FDA）已經(jīng)批準(zhǔn)HE4用于臨床監(jiān)測卵巢癌的復(fù)發(fā)與進(jìn)展，而HE4在乳腺癌中的作用還鮮有報道。所以本研究旨在探討人附睪蛋白4（HE4）在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中的機(jī)制研究。
　　方法：
　　第一部分：
　　采用細(xì)胞培養(yǎng)和引入藥物使細(xì)胞具有抗性，采用半抑制濃度來測定抗性指數(shù)，采用反轉(zhuǎn)錄和實時定量PCR檢測mR

9、NA的表達(dá)水平，Western Blotting（蛋白印跡法）檢測MMP-2/9、STAT3、P-STAT3、ERK1/2、P-ERK1/2蛋白表達(dá)水平，免疫熒光測定法測定 SK-BR-3細(xì)胞以及無表柔比星培養(yǎng)基中培養(yǎng)的SK-BR-3/EPR中P糖蛋白表達(dá)，利用細(xì)胞增殖與克隆形成實驗SK-BR-3/EPR的細(xì)胞增殖情況，細(xì)胞侵襲實驗驗證細(xì)胞侵襲能力的變化。
　　第二部分：
　　采用實時熒光定量PCR（RT-qPCR）檢測15

10、例原發(fā)乳腺癌組織及其配對的癌旁正常組織中HE4 mRNA的表達(dá)水平。RT-qPCR和Western blot檢測常見乳腺（癌）細(xì)胞系中HE4 mRNA和蛋白表達(dá)水平。通過RNA干擾技術(shù)沉默HE4高表達(dá)的乳腺癌SK-BR-3細(xì)胞中HE4表達(dá)，通過CCK-8和克隆形成實驗分析沉默HE4表達(dá)對SK-BR-3細(xì)胞細(xì)胞增殖的影響。流式細(xì)胞術(shù)檢測沉默HE4表達(dá)對SK-BR-3細(xì)胞凋亡的影響。Western blot檢測沉默HE4表達(dá)對Erk和Akt

11、磷酸化水平的影響。
　　結(jié)果：
　　第一部分：
　　升高 P-糖蛋白表達(dá)量，SK-BR-3/EPR會獲得多藥耐藥表型；SK-BR-3/EPR在隨后沒有表柔比星的培養(yǎng)基里連續(xù)培養(yǎng)六周后還具有多藥耐藥的表型；SK-BR-3/EPR細(xì)胞在細(xì)胞增殖率方面有顯著減低，而侵襲能力卻表現(xiàn)出增強(qiáng)；
　　SK-BR-3/EPR中MMP2/9表達(dá)上調(diào)；SK-BR-3/EPR細(xì)胞中磷?；蚐TAT3的激活增加；STAT3的敲減抑制了細(xì)

12、胞的侵襲能力同時也下調(diào)了 SK-BR-3/EPR細(xì)胞中MMP2/9的表達(dá)。
　　第二部分：
　　HE4 mRNA在乳腺癌組織中高表達(dá)；沉默HE4表達(dá)抑制乳腺癌細(xì)胞SK-BR-3細(xì)胞增殖能力，并促進(jìn)其凋亡，Erk和Akt蛋白磷酸化水平降低。
　　結(jié)論：
　　1、成功建立了P糖蛋白過表達(dá)的乳腺癌細(xì)胞系SK-BR-3/EPR。
　　2、SK-BR-3/EPR細(xì)胞表現(xiàn)出侵襲能力增強(qiáng)的特性，同時細(xì)胞中 MMP-2/9