利用SELDI-TOF-MS技術(shù)篩選原發(fā)性肝癌血清腫瘤標(biāo)志物.pdf

1、研究背景與目的:原發(fā)性肝癌(PHC)是世界上最常見的惡性腫瘤之一,在許多地區(qū)其發(fā)病率有逐年增高的趨勢(shì)。對(duì)于具有典型臨床表現(xiàn)者其診斷并不困難,但這時(shí)患者往往已界中晚期,預(yù)后不佳。因此原發(fā)性肝癌的早期診斷和治療一直為臨床和科研工作者所關(guān)注,而尋找具有高靈敏度和高特異性的原發(fā)性肝癌特異性腫瘤標(biāo)志物則是原發(fā)性肝癌早期診斷的關(guān)鍵所在。原發(fā)性肝癌是一種多基因、多步驟、具有復(fù)雜性狀的疾病,包含了多個(gè)基因突變分子事件的過程,如抑癌基因的功能喪失、癌基因

2、的活化等。因此用單個(gè)因子的檢測(cè)對(duì)原發(fā)性肝癌進(jìn)行早期診斷和預(yù)后的估計(jì),以及隨訪監(jiān)測(cè)必定不可避免地存在敏感性和特異性的矛盾。近年來,隨著多腫瘤標(biāo)志物生物芯片在臨床中的應(yīng)用,腫瘤的早期診斷準(zhǔn)確率有所提高,但由于多腫瘤標(biāo)志物生物芯片作為臨床腫瘤的廣譜篩選手段,對(duì)單一腫瘤的特異性不高,且多腫瘤標(biāo)志物的檢測(cè)局限于分子量較大的蛋白質(zhì),而血清蛋白質(zhì)組中低分子量(<15 kD)蛋白也可能包含有大量生物標(biāo)志物。此外,在疾病發(fā)展過程中一系列酶解或蛋白水解過程

3、產(chǎn)生了大量蛋白片段,其中大部分通過腎臟排泄,血液中所攜帶的血清標(biāo)志物濃度很低,常規(guī)蛋白檢測(cè)技術(shù)很難發(fā)現(xiàn)。九十年代初表面增強(qiáng)激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(SELDI-TOF-MS)技術(shù)的出現(xiàn)為臨床蛋白質(zhì)組學(xué)的研究提供了強(qiáng)有力的工具,可以克服以往蛋白檢測(cè)技術(shù)所固有的缺陷。蛋白質(zhì)芯片系統(tǒng)將蛋白質(zhì)保留在固相層析表面,經(jīng)離子化后用電離飛行時(shí)間質(zhì)譜檢測(cè),利用這種技術(shù)可對(duì)血清、尿液、細(xì)胞裂解液等生物樣品直接進(jìn)行檢測(cè)。本研究旨在利用表面增強(qiáng)激光解析電離飛行

4、時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)篩選原發(fā)性肝癌特征性血清標(biāo)志蛋白質(zhì)。 材料與方法:采用美國Ciphergen公司的IMAC芯片和表面增強(qiáng)激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜儀,檢測(cè)590份血清標(biāo)本中的蛋白質(zhì)相對(duì)含量,其中包括297例原發(fā)性肝癌術(shù)前患者,45例肝癌治療后患者,63例病毒性肝炎患者、62例肝炎肝硬化患者和123例正常人的血清,得到各組蛋白質(zhì)的質(zhì)譜圖。進(jìn)一步采用Ciphergen Biosystems軟件進(jìn)行波譜分析,從而得到能夠正確分組的特異性蛋白

5、標(biāo)志物并構(gòu)建原發(fā)性肝癌診斷模型。 結(jié)果:獲得的質(zhì)譜圖用Ciphergen公司的Biomarker Wizard和Biomarker Pattern軟件分析。篩選出的特異蛋白峰與肝功能Child-Pugh分級(jí)、血清AFP水平、腫瘤體積和轉(zhuǎn)移情況等臨床因素?zé)o關(guān)。肝癌組與正常人組相比有43個(gè)蛋白含量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,以M/Z值(質(zhì)荷比)為7777.28Da和9424.66Da的蛋白質(zhì)作為血清標(biāo)志物建立診斷模型可將正常人與肝癌患者準(zhǔn)確的

6、分組,敏感性94.3％,特異性94.3％。肝癌與肝炎組有97個(gè)蛋白含量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,以M/Z值為5908.05Da、6012.53Da 8128.68Da、9100.18Da的蛋白質(zhì)作為標(biāo)志物建立診斷模型可將病毒性肝炎與肝癌患者準(zhǔn)確的分組,敏感性97.6％,特異性96.8％。肝癌與肝硬化組之間有108個(gè)蛋白含量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,以M/Z值為8127.79Da蛋白質(zhì)作為生物標(biāo)志物可將肝炎肝硬化與肝癌患者準(zhǔn)確的分組,敏感性85.9％,特

7、異性93.5％。肝癌與良性肝病組之間有31個(gè)蛋白含量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,以M/Z值為8129.44Da蛋白質(zhì)作為生物標(biāo)志物可將良性肝病與肝癌患者準(zhǔn)確的分組,敏感性90.2％,特異性95.2％。肝癌治療前后兩組有91個(gè)蛋白含量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,以M/Z值為8127.41Da、10079.4 Da、4140.12 Da三個(gè)蛋白質(zhì)作為生物標(biāo)志物可將肝癌治療前后患者準(zhǔn)確的分組,敏感性91.9％,特異性97.8％。以M/Z值約為8129.44Da的

8、蛋白質(zhì)(最小值8119.6Da、最大值8138Da)作為肝癌的生物標(biāo)志物建立診斷模型,隨機(jī)抽取肝癌與非腫瘤血清標(biāo)本進(jìn)行雙盲驗(yàn)證,結(jié)果表明以M/Z值為8129.44Da的蛋白質(zhì)作為生物標(biāo)志物可以將肝臟腫瘤與非腫瘤準(zhǔn)確地分組,敏感性96.3％,特異性83.8％。 結(jié)論:利用表面增強(qiáng)激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)對(duì)原發(fā)性肝癌患者(包括手術(shù)前后)、肝臟良性疾病患者及正常人血清的血清蛋白質(zhì)譜進(jìn)行分析,得到的高敏感性和特異性血清蛋白質(zhì)模板,可