基于噬菌體模擬表位的有機磷農(nóng)藥多殘留免疫檢測方法的研究.pdf

1、有機磷農(nóng)藥是一類具有廣譜殺蟲特性和較低穩(wěn)定性的農(nóng)藥，已被廣泛應用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中。但是，有機磷農(nóng)藥會抑制膽堿酯酶的活性，過度或不合理的使用會對人類健康構成威脅，因此，建立一種快速、簡單、準確的檢測環(huán)境和食物中有機磷農(nóng)藥殘留的分析方法是十分必要的。酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）具有檢測成本低、檢測速度快并且可以同時檢測多個樣品的優(yōu)勢，被廣泛地應用于有機磷農(nóng)藥殘留檢測。
　　本實驗室前期制備的有機磷農(nóng)藥寬譜單克隆抗體3A7具有較好的寬譜特

2、異性，但是仍存在靈敏度不足的問題。為了進一步提高檢測的靈敏度，本研究采用噬菌體展示技術篩選有機磷農(nóng)藥的抗原模擬表位，并建立了更加靈敏的基于噬菌體模擬表位的免疫分析方法。主要研究結果如下：
　?。?）本研究以有機磷農(nóng)藥寬譜特異性單克隆抗體3A7為靶標，同時使用噬菌體隨機展示線性七肽庫、線性十二肽庫和環(huán)七肽庫混合肽庫，經(jīng)過四輪生物淘選成功地將噬菌體進行了富集，回收率從1.2×10-7提高到了1.1×10-2。挑取179個噬菌體單克隆用

3、于間接競爭ELISA檢測，在250ng/mL對硫磷存在下，有競爭作用的有91個，挑取效果較好的14個單克隆進行測序。測序結果表明，篩選到了5種有機磷農(nóng)藥模擬表位，包括1種線性七肽模擬表位和4種線性十二肽模擬表位。
　　（2）為了使建立的P-ELISA具有更高的靈敏度，以Amax/IC50的比值為標準選擇了噬菌體肽21為最佳的噬菌體抗原。通過對甲醇濃度、脫脂奶粉濃度、pH和離子強度的優(yōu)化，確定了噬菌體肽21使用的最優(yōu)條件為pH6.5

4、，5×PBS，2.5％甲醇和0.4%脫脂奶粉。
　　（3）在最優(yōu)檢測條件下，建立的P-ELISA對多種有機磷農(nóng)藥具有交叉反應，尤其是對8種O,O-二乙基類和6種O,O-二甲基類有機磷農(nóng)藥具有較強的交叉反應，對這14種農(nóng)藥的IC50值在5.24-63.25ng/mL之間，平均IC50值為37.04ng/mL，變異系數(shù)為42.98%。與化學合成包被原建立的異源 ELISA相比，P-ELISA對有機磷農(nóng)藥的靈敏度都有所提高，對倍硫磷的靈

5、敏度提高了3倍以上，除對甲基毒死蜱和乙基嘧啶磷的靈敏度提高2倍外，對其余17種有機磷農(nóng)藥的靈敏度均提高了1倍左右。
　?。?）樣品的添加回收實驗結果顯示，對硫磷、倍硫磷、二嗪農(nóng)和殺螟硫磷在黃瓜、生菜、蘋果和西瓜樣品中的添加回收率在82.03-103.63%之間，變異系數(shù)在2.31-13.80%之間，說明建立的 P-ELISA檢測方法適用于蔬菜和水果等樣品中的有機磷農(nóng)藥殘留檢測。
　　總之，噬菌體具有無毒、易擴增、靈敏度高和使