噬菌體展示技術(shù)體內(nèi)篩選小鼠腎臟特異性多肽.pdf

1、目的：本課題旨在利用噬菌體隨機(jī)多肽文庫(kù)對(duì)小鼠進(jìn)行體內(nèi)篩選，獲得小鼠腎臟血管特異性多肽。 方法：1、小鼠的體內(nèi)篩選實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為6-8周的SPF級(jí)雌性Balb/c鼠，乙醚麻醉小鼠后尾靜脈注射C7C噬菌體多肽文庫(kù)200μl，循環(huán)10分鐘后，將小鼠再次麻醉，打開胸腔，心臟灌注預(yù)熱的TBS約50ml。分離腎臟，洗滌后稱重、研磨。研磨液經(jīng)三次洗滌后一部分進(jìn)行噬菌體滴度測(cè)定，余下的鋪IPTG/X-gal平板，刮取平板上至少200個(gè)藍(lán)色噬菌斑，感

2、染處于對(duì)數(shù)中期的大腸桿菌ER2738，并在ER2738內(nèi)進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增后的噬菌體同樣進(jìn)行滴度測(cè)定，計(jì)算下一輪循環(huán)所需要的噬菌體量。重復(fù)以上操作進(jìn)行三輪循環(huán)。 2、多肽測(cè)序第三輪循環(huán)后，測(cè)定未擴(kuò)增噬菌體洗液滴度，隨機(jī)擴(kuò)增滴度測(cè)定板上24個(gè)藍(lán)色單克隆，分別提取其DNA。用試劑盒內(nèi)的-96gIII引物在全自動(dòng)測(cè)序儀上進(jìn)行測(cè)序列，并分析這些多肽的共有序列。 3、免疫組化染色將出現(xiàn)次數(shù)最多的多肽噬菌體注入Balb/c鼠體內(nèi)，循環(huán)1

3、0分鐘后心臟灌注，收獲其腎臟，制成新鮮的冰凍切片，先后與抗M13單克隆抗體和辣根過氧化物酶連接的兔抗小鼠單克隆抗體進(jìn)行孵育，最后加底物DAB顯色，以小鼠腦，心臟，肺，肝作為對(duì)照。 結(jié)果：經(jīng)過三輪篩選，特異性結(jié)合于小鼠腎臟血管的噬菌體得到富集，測(cè)序結(jié)果顯示多肽序列VSASYHR出現(xiàn)的概率最大(62.5％)，其次為GQWGARG(25％)。免疫組化染色顯示以上兩種多肽噬菌體均富集于小鼠腎臟，與腎臟血管內(nèi)皮特異性結(jié)合。 結(jié)論：