結(jié)腸癌特異性噬菌體抗體篩選及鑒定的初步研究.pdf

1、背景和目的：腫瘤是全球范圍內(nèi)嚴(yán)重危害人類生命健康的重大疾病之一，世界上每年因罹患腫瘤而喪失生命的人約占總死亡人數(shù)的20％。隨著科學(xué)家們對(duì)原發(fā)腫瘤的生長、浸潤、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)以及組織微環(huán)境等因素研究的逐步深入腫瘤的診斷與治療方法也取得了很大進(jìn)展，目前已有的治療手段包括手術(shù)、放療和化療等，但是這些治療仍然存在治愈率低、藥物副作用大、腫瘤轉(zhuǎn)移與復(fù)發(fā)等諸多問題。近年來，越來越多的研究提示腫瘤的起源、發(fā)生、轉(zhuǎn)移與復(fù)發(fā)的原因可能是腫瘤內(nèi)存在極少量具有干

2、細(xì)胞特性的細(xì)胞，即腫瘤干細(xì)胞(Tumor Stem Cells，TSCs)。腫瘤干細(xì)胞有以下特點(diǎn)：第一、自我更新能力；第二、多向分化潛能；第三、高致瘤性；第四、存在與干細(xì)胞相似的信號(hào)傳導(dǎo)通路；第五、高遷徙和轉(zhuǎn)移能力；第六、對(duì)射線和藥物不敏感；第七、多藥抗藥性。CD133作為腫瘤干細(xì)胞的表面標(biāo)志物最早是在腦腫瘤中發(fā)現(xiàn)的，Singh等從神經(jīng)節(jié)膠質(zhì)瘤、星形膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中成功地分離出 CD133+腫瘤干細(xì)胞，并將其在體外無血清培養(yǎng)基中進(jìn)行細(xì)胞培

3、養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)這種細(xì)胞能形成神經(jīng)球樣克隆，具有自我更新和分化能力，同時(shí)能在免疫缺陷小鼠體內(nèi)形成腫瘤，腫瘤細(xì)胞的亞型；與原位腫瘤一樣，而且也能連續(xù)傳代。另外，研究證明 CD133+細(xì)胞在肝、胰腺癌、結(jié)腸癌、前列腺癌、乳腺癌、喉癌、胃癌、腎癌等多種實(shí)體瘤研究中發(fā)揮重要作用，CD133成為分離培養(yǎng)和鑒定腫瘤干細(xì)胞特異性標(biāo)志之一。近幾年針對(duì)腫瘤干細(xì)胞的研究，更注重從其分子和基因水平等方面進(jìn)行分析，結(jié)果表明 CD133這種細(xì)胞表面粘附分子與其他細(xì)胞因子

4、以及腫瘤微環(huán)境的形成，共同參與腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)、細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路的調(diào)節(jié)以及放化療抵抗的作用。因此，我們可以從阻斷腫瘤干細(xì)胞的細(xì)胞周期、阻斷信號(hào)傳導(dǎo)通路的激活、改變放化療作用靶點(diǎn)、干擾腫瘤干細(xì)胞微環(huán)境等方面開展針對(duì)腫瘤干細(xì)胞表面標(biāo)志物CD133以及腫瘤相關(guān)途徑的靶向治療。所以，制備高特異性抗CD133的人源性單克隆抗體有重要意義。
　　方法：人CD133是五次跨膜的糖蛋白由兩個(gè)長胞區(qū)，我們用PCR擴(kuò)增 CD133兩段胞外區(qū)，分

5、別將擴(kuò)增的兩段胞外區(qū)與PGEX4T-1(6*HIS)質(zhì)粒結(jié)合后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入BL21大腸桿菌中培養(yǎng)，IPTG大量誘導(dǎo)表達(dá)，鎳柱純化。以純化后的CD133-loop1-(HIS)6和CD133-loop2-(HIS)6蛋白作為靶分子，對(duì)噬菌體抗體庫進(jìn)行固相篩選，應(yīng)用夾心ELISA選擇出結(jié)合較強(qiáng)的克隆。
　　結(jié)果：成功表達(dá)出CD133兩段胞外區(qū)，經(jīng)ELISA鑒定表明純化后的兩段CD133胞外區(qū)抗原與CD133抗體有特異性的結(jié)合。因本次

6、使用的scFv抗體庫為無偏性的天然文厙，所以采用了五輪篩選，前兩輪采用中等的嚴(yán)密度，避免高親和力但低表達(dá)的噬菌體克隆丟失。后三輪的嚴(yán)格篩選達(dá)到了篩選目的。第五輪噬菌體的投入產(chǎn)出率比第三輪增加了42.5倍。將五輪篩選獲得的多克隆噬菌體均進(jìn)行ELISA檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)五輪篩選的OD450nm吸光度值逐漸升高。以第五輪篩選后獲選后的多克隆噬菌體感染宿主菌 XL1-blue，挑取其中的單個(gè)菌落，制備出101株單克隆噬菌體抗體，用ELISA測(cè)定其抗原結(jié)