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文檔簡介
1、腸出血性大腸桿菌(entrerohemorrhagic E.coli,EHEC)0157:H7是一種新型的腸道致病菌,可引起嚴重的食源性疾病。感染該菌可致腹瀉、出血性結腸炎(hemorrhagiccolitis,HC),還可引發(fā)溶血性尿毒綜合征(hemolytic uremic syndrome,HUS)及血栓性血小板減少紫癜(thrombotic thrombocytopenic purpura,TTP)等嚴重并發(fā)癥,嚴重者可導致死亡
2、[1-3]。 目前,對EHEC0157:H7感染仍缺乏有效的治療方法。臨床上針對其感染主要采用抗生素治療及相應的對癥治療。新近的研究發(fā)現(xiàn),抗生素使菌體破裂,導致0157:H7菌志賀毒素(Shiga toxin,Stx)的釋放水平大大提高,使用抗生素有可能加重病情,增加發(fā)生并發(fā)癥的危險并引起死亡。 EHEC0157:H7主要產生兩種毒素,分別稱為志賀毒素I(Stx1)和志賀毒素II(Stx2)。目前,Stx2與配體腺嘌呤
3、的復合物晶體結構已被解析[5,6],毒素的活性位點也已明確。A亞單位包括A1和A2兩個片段。A1片段為毒性活性片段,毒力活性中心位點位于第77位酪氨酸上,A2片段插入5個B亞基形成的孔中,通過B亞基與細胞受體結合而發(fā)揮毒力作用。因此,直接針對EHEC0157: H7最主要的致病活性分子Stx2A研制其中和毒素抗體,將是研制0157: H7治療性抗體藥物優(yōu)選的設計策略。但由于鼠源性單抗應用人體會引起人抗鼠抗體反應(HAMA),這為臨床實際
4、應用帶來了不便,因此制備特異性人源化抗體是目前待解決的問題??乖砦欢ㄏ蜻x擇法(EGS)是近年發(fā)展的快速人源化抗體的新方法。該方法通常是先用親本鼠單抗重(或輕)鏈可變區(qū)基因與人源抗體輕(或重)鏈基因庫配對,構建成鼠.人雜合噬菌體抗體庫,以固相化抗原進行親和篩選,得到與鼠源重(或輕)鏈組合識別特異抗原的人源輕(或重)鏈基因。進一步用篩到的特異性人抗體輕(或重)鏈去配人源重(或輕)鏈基因庫,構建成人源噬菌體抗體庫,再經同一抗原進行親和力篩選
5、,從而獲得與親本鼠源抗體針對同一表位的完全人源化的新型抗體。本研究擬采用抗原表位定向選擇法,對構建的鼠源抗EHEC0157: H7 Stx2ai噬菌體抗體進行人源化改造,從而為解決臨床EHEC0157:H7感染者的治療研究奠定實驗基礎。 第一部分:EHEC O157:H7 Stx2A1亞單位截短片段Stx2a1的克隆、表達、純化及免疫學性質鑒定 目的:表達、純化EHEC O157:H7 Stx2A1毒力亞單位截短片段St
6、x2a1對其免疫性進行鑒定。方法:應用生物信息學軟件DNAstar對Stx2A1全長序列進行分析,根據(jù)分析結果將全長Stx2Ai羧基端疏水性很強的部分氨基酸截短,從EHEC0157:H799A021基因組中擴增stx2ai,克隆于pET-22b(+)載體,轉化到工程菌Escherichia coli BL21(DE3)中。用IPTG誘導表達融合蛋白。對表達產物進行SDS-PAGE蛋白電泳及Western blot分析。結果:Stx2ai
7、經0.1 mM IPTG誘導為可溶形式表達,SDS-PAGE蛋白電泳表明表達及純化的蛋白的相對分子量約為25 kDa,純化出的Stx2ai蛋白含量達98%以上,Western blot鑒定顯示該蛋白可與抗Stx2A單抗SID8特異性反應。結論:成功表達純化出EHEC O157:H7 Stx2A1毒力亞單位截短片段Stx2a1,這為下一步篩選到抗EHECO157:H7毒力亞單位的抗體奠定了抗原基礎。 第二部分:鼠源性抗EHEC O
8、157:H7 Stx2噬菌體Fab抗體庫的構建及篩選 目的:以滅活的天然毒素Stx2免疫小鼠制備鼠源性抗EHEC O157:H7 Stx2噬菌體Fab抗體庫,篩選鼠源性抗EHEC O157:H7 Stx2aiFab抗體。方法:甲醛法滅活天然毒素Stx2,類毒素免疫小鼠,利用RT-PCR從脾淋巴細胞擴增出全套的鼠Fab抗體的輕、重鏈,克隆入pComb3x噬粒載體中,電轉化大腸桿菌XL1-Blue后建立鼠源性抗EHECO157:H7
9、 Stx2噬菌體Fab抗體庫。通過稀釋滴定、限制性酶切對所建的抗體庫的庫容、重組率分別進行鑒定,以M13K07輔助噬菌體超感染,先用天然毒素Stx2為抗原對挽救展示的噬菌體抗體庫進行淘篩和鑒定,然后對篩選到的抗體進行抗原亞單位的特異性鑒定,最后對篩選到了針對Stx2a1的Fab抗體的陽性克隆進行測序及比對。結果:成功構建1.56×107CFU、重組率為80%的鼠源性噬菌體抗體庫。首先利用純化的天然毒素Stx2進行三輪淘選后,對篩選到的抗
10、體再進行Stx2a1抗原的特異性鑒定,得到兩個陽性克隆,測序后NCBI中比對及同源性分析表明,其中輕鏈可變區(qū)氨基酸序列與GenBank中已注冊的鼠免疫球蛋白K輕鏈、重鏈可變區(qū)氨基酸序列同源性為98.5%、99.6%左右。結論:成功構建了鼠源性抗EHEC0157:H7 Stx2噬菌體Fab抗體庫,并篩選到兩株鼠源性抗EHEC O157:H7 Stx2a1噬菌體Fab抗體庫。 第三部分抗天然Stx2毒素活性片段Stx2a1的人源噬菌
11、體Fab抗體庫的構建及特異性人源Fab抗體的篩選、表達 目的:分別以鼠源抗Stx2a1的輕、重鏈為模板,篩選人源性抗Stx2a1抗體的重、輕鏈,構建人源性抗Stx2ai的噬菌體Fab抗體。進而從全人噬菌體Fab抗體庫中篩選出抗Stx2ai的Fab抗體,進行表達鑒定。方法:利用RT-PCR從正常人全血淋巴細胞擴增出全套的人Fab抗體的輕鏈基因,克隆入含鼠源性重鏈的pComb3x/mFd噬粒載體中,電轉化大腸桿菌XL1-Blue后建
12、立人鼠雜合抗EHEC O157:H7 Stx2a1噬菌體Fab抗體庫。通過稀釋滴定、限制性酶切對所建的抗體庫的庫容、重組率分別進行鑒定,以M13K07輔助噬菌體超感染,對篩選到的抗體進行Stx2ai抗原亞單位的特異性篩選鑒定。再以同樣方法技術,利用RT-PCR從正常人全血淋巴細胞擴增出全套的人Fab抗體的重鏈Fd基因,將其與已篩選到的人抗體輕鏈配對構建針對Stx2a1的全人Fab抗體,以純化的Stx2ai為抗原,經過三輪吸附-洗脫-擴增
13、,最后對phage ELISA篩選到的陽性克隆進行誘導表達及Western blot特異性鑒定。結果:成功構建3.1×106CFU、重組率為90%的全人Fab噬菌體抗體庫。對phage ELISA篩選到的抗體誘導表達,得到兩個可溶性表達產物,經Western blot特異性鑒定均是針對抗原Stx2a1的抗體。結論:通過抗原表位定向選擇法,成功得到了全人抗EHEC O157:H7 Stx2a1噬菌體Fab抗體庫,并篩選到兩株人源性抗EHE
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