人源化單鏈抗體噬菌體庫的構(gòu)建及抗TNF-α抗體的篩選.pdf

1、人源化單鏈抗體噬菌體庫的構(gòu)建及抗人源化單鏈抗體噬菌體庫的構(gòu)建及抗TNFα抗體的篩選抗體的篩選ConstructionofahumanscFvphagedisplaylibraryionofantibodytohumanTNFα一級學(xué)科：化學(xué)工程與技術(shù)學(xué)科專業(yè)：應(yīng)用化學(xué)（藥）作者姓名：劉運超指導(dǎo)老師：常俊標(biāo)天津大學(xué)藥物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院2012年06月摘要摘要摘要抗體是體液免疫系統(tǒng)的重要組成部分，也在生命科學(xué)研究、疫病檢測和醫(yī)藥領(lǐng)域發(fā)揮著重要

2、作用。噬菌體展示技術(shù)是人源治療性抗體的重要技術(shù)來源之一。TNFα是一種前炎癥因子，與風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等多種疾病的發(fā)生密切相關(guān)。本研究采用噬菌體抗體展示技術(shù)構(gòu)建一個人源噬菌體抗體庫，并從中篩選出具有TNFα細胞毒活性抑制作用的人源單鏈抗體。依據(jù)文獻報道的人抗體恒定區(qū)序列及人源抗體各胚系基因序列，本研究設(shè)計42條引物，以200份人外周血中分離的總RNA為模板，利用這些引物擴增出了抗體的重鏈（VH）和輕鏈（VL）可變區(qū)基因?？贵w重鏈可變區(qū)的擴增和

3、組裝采用三輪OEPCR反應(yīng)完成：首先分別擴增VH的CDR1、CDR2、CDR3和FR3，然后采用OEPCR拼接重鏈的CDR1和CDR2、CDR3和FR3的基因片段，再將兩者拼接成完整的人抗體VH基因。VL基因的擴增采用PCR方法從總RNA中經(jīng)多次反應(yīng)獲得，再將其與VH基因連接形成完整的scFv基因。噬菌體庫的構(gòu)建采用載體pCANTAB5E、E.coliTG1和輔助性噬菌體M13KO7。將scFv基因插入pCANTAB5E載體酶切位點Sf

4、iI和NotI之間，并將新載體轉(zhuǎn)化E.coliTG1。輔助噬菌體M13KO7侵染轉(zhuǎn)化后的TG1，構(gòu)建scFv噬菌體庫。梯度稀釋法測得噬菌體庫庫容為2.5107，噬菌體滴度為1012pfu?；驕y序顯示E.coliTG1中轉(zhuǎn)化DNA與預(yù)期相符，抗體重鏈各區(qū)域組合正確，VH和VL之間有柔性多肽編碼基因相連。采用微孔板篩選法以人TNFα、禽流感NS1蛋白、人血清白蛋白HSA、牛血清白蛋白OVA和PRRSV病毒GP5蛋白對文庫進行淘選，結(jié)果顯示

5、五種蛋白在淘選過程中均能有效富集。為獲得高親和力的抗TNFα抗體，依據(jù)phageELISA實驗結(jié)果從隨機挑選的87株重組噬菌體中篩選出4株陽性克隆進行重組蛋白表達和抗TNFα活性測試。重組蛋白的表達采用pET28a載體和大腸桿菌BL21（DE3）菌株。IPTG誘導(dǎo)后SDSPAGE電泳顯示scFv重組蛋白在大腸桿菌中大量表達，重組蛋白的表達量占菌體量的40%左右，經(jīng)鎳柱純化的蛋白純度在90%以上。MTT法檢測TNFα殺傷L292細胞的活性