全人源抗鼻咽癌噬菌體單鏈抗體庫(kù)的構(gòu)建與初步篩選.pdf

1、目的：構(gòu)建全人源抗鼻咽癌噬菌體單鏈抗體庫(kù)，從抗體庫(kù)中篩選抗鼻咽癌的噬菌體單鏈抗體(ScFv)，并對(duì)其進(jìn)行鑒定和測(cè)序分析。 方法：體外致敏并用EBV轉(zhuǎn)化鼻咽癌患者的PBMC。用PCR分別擴(kuò)增Ⅷ和VL基因并組成ScFv基因。將ScFv基因與載體fuse5連接后，電擊轉(zhuǎn)化大腸桿菌MC1061，構(gòu)建噬菌體呈現(xiàn)型ScFv庫(kù)。用人鼻咽癌細(xì)胞系CNE2及人胚肺成纖維細(xì)胞系HFF對(duì)初級(jí)噬菌體抗體庫(kù)進(jìn)行親和富集phage=-ELISA篩選。篩選獲

2、得的陽(yáng)性克隆進(jìn)行ELISA及免疫組化鑒定并測(cè)序。 結(jié)果：經(jīng)EBV轉(zhuǎn)化的3例鼻咽癌患者PBMC，ELISA檢測(cè)均有抗鼻咽癌抗體產(chǎn)生，經(jīng)多次PCR，擴(kuò)增出6種vH(γ、μ)和9種VL(к、λ)基因，經(jīng)連接組成54種ScFv基因。將ScFv基因與載體連接后，導(dǎo)入大腸桿菌MC1061。經(jīng)四環(huán)素抗性篩選，得到庫(kù)容量為615×10<'7>的初級(jí)噬菌體抗體庫(kù)，噬菌體DNA中全長(zhǎng)ScFv基因的插入率為100％。用人鼻咽癌細(xì)胞系CNE2和人胚肺成

3、纖維細(xì)胞系HFF對(duì)抗體庫(kù)進(jìn)行三輪正負(fù)淘選和富集后，從中隨機(jī)挑取828個(gè)克隆進(jìn)行ELISA篩選，得到245個(gè)陽(yáng)性克隆，陽(yáng)性率為29.6％。將245個(gè)陽(yáng)性克隆進(jìn)一步進(jìn)行其他細(xì)胞系的ELISA鑒定，發(fā)現(xiàn)克隆F20與三株鼻咽癌細(xì)胞系CNE2、HNE2和CNE1均呈陽(yáng)性反應(yīng)，而與人胚肺成纖維細(xì)胞系HFF、骨髓間質(zhì)干細(xì)胞系HBMSC、原代培養(yǎng)的臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC及其他人腫瘤細(xì)胞系反應(yīng)呈弱陽(yáng)性或不反應(yīng)。免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果與細(xì)胞ELISA結(jié)果基本一

4、致；免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示：與10例人鼻咽癌組織呈不同程度陽(yáng)性反應(yīng)，反應(yīng)部位主要見(jiàn)于胞膜、胞漿，而與5例正常鼻黏膜組織均無(wú)陽(yáng)性反應(yīng)。對(duì)克隆F20進(jìn)行測(cè)序分析，結(jié)果表明：克隆F20的重鏈可變區(qū)基因與人胚系IgVH3-23有92.8％的同源性，輕鏈可變區(qū)基因與人胚系IgV4-2有94.2％的同源性；V-D-J 分別屬于VH3-23-D6-6-JH6-linker-V4-2-JL2。 結(jié)論：應(yīng)用體外抗原致敏方法和EBV轉(zhuǎn)化技術(shù)聯(lián)合噬菌體