豬圓環(huán)病毒Ⅱ型Cap蛋白噬菌體單鏈抗體庫的構建與篩選.pdf

1、豬圓環(huán)病毒Ⅱ型（Porcine circovirus, PCV2）是引起豬圓環(huán)病毒?。≒orcine circovirus disease, PCVD）的主要病原，它能損害患病仔豬的免疫系統(tǒng)，引發(fā)其他多種病原混合感染或繼發(fā)性感染，導致豬的繁殖能力嚴重下降，給養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大的經濟損失。PCV2感染的早期診斷對 PCVD的綜合防控具有重大意義。目前，針對 PCV2病原的快速檢測方法主要有膠體金免疫層析試紙法和ELISA檢測方法等，其所用抗

2、體主要是基于雜交瘤細胞制備的單克隆抗體，傳統(tǒng)單克隆抗體存在生產周期長、成本高、穩(wěn)定性差等缺點，在一定程度上限制了 PCV2快速、高效、廉價的檢測方法的研制。而基因工程方法制備的單鏈抗體具有生產周期短，成本低、易于改造等優(yōu)點，其有望取代傳統(tǒng)單抗用于 PCV2新型免疫學檢測方法的研制。實驗的主要內容與結果如下：
　　1. PCV2 Cap蛋白的純化及鑒定
　　本實驗將重組表達載體 pET28a-ORF2轉入大腸桿菌 BL21中，

3、用 IPTG誘導表達，利用 Ni-NTA親和層析法對目的蛋白進行純化，并對蛋白進行鑒定。結果顯示表達的重組蛋白分子量約26 kDa，主要以可溶形式存在，且能被 His單克隆抗體特異性識別，純化后的重組蛋白純度比較高。用此蛋白免疫 BALB/C鼠，免疫后，經 ELISA檢測，測得鼠血清中抗體滴度達1∶64000，同時用 PCV2抗體檢測試紙對鼠血清進行檢測，結果為陽性。本實驗制備的重組 Cap蛋白具有可溶性好、純度高、免疫原性好等特點，為

4、 Cap蛋白單鏈抗體庫的構建提供了必要的實驗材料。
　　2. PCV2 Cap蛋白噬菌體單鏈抗體庫的構建及淘選
　　選取免疫效果較好的小鼠脾臟，提取其脾臟總 RNA，再以反轉錄后的cDNA為模板，PCR擴增抗體的重鏈可變區(qū)基因（Heavy chain variable region of antibody, VH）和抗體的輕鏈可變區(qū)基因（Light chain variable region of antibody, VL）

5、，經重疊PCR將VH與VL用多肽(G4S)3連接，獲得單鏈抗體基因（Single chain antibody variable region gene fragment, ScFv）。經輔助噬菌體輔助侵染后獲得噬菌體單鏈抗體庫，用 Cap蛋白作為包被原篩選 PCV2單鏈抗體克隆，獲得3株與 Cap蛋白特異性反應的噬菌體克隆。取特異性及反應性相對較高的克隆測序，獲得 PCV2單鏈抗體基因，并用 ELISA鑒定 ScFv-P18菌株的誘導