人源性抗CEA噬菌體抗體庫的構建.pdf

1、東南大學碩士學位論文人源性抗CEA噬菌體抗體庫的構建姓名：丁向民申請學位級別：碩士專業(yè)：臨床醫(yī)學指導教師：范健20030525東南大學傾I 。學位論文C o n s t r u c t i o no f H u m a n P h a g e A n t i b o d yL i b t ‘a r y A g a i n s t C a r c i n o e m b r y o n i c A n t i g e nA b s t r

2、 a c tG Ia d u a t e ：D I N GX i a n g - m i n S u p e J ‘v i s o r ：P r o f ．F A N J i a nC l i n i c a lM e d i c a lc o l l e g eo f S o u t h e a s t U n i v e r s i t yO b j e c t i v e A l m m a np h a g ea n t i b

3、 o d y l i b r a r y a g a i n s t c a r c i n o e m b r y o n i c a n t i g e nw a sc o n s t r u c t e di nt h i ss t u d y , v i a w h i c h h u m a n a n t i b o d i e so f s m a l l m o l e c u l e ．s t r o n gp e n

4、 e t r a b i l i t ya n d f r e eo f h u m a n a n t i —m o u s er e a c t i o n s c o u l d b eo b t a i n e d ．A p p l i c a t i o n o f h u m a n m o n o c l o n a la n t i b o d y a s c a r r i e r s p r o m o t e s

5、t h e d e v e l o p m e n to ft a r g e t i n gd r u g s i n t u m o r w i t h l l i g he x p r e s s i o nC E A ：M e t h o d s I n t h i s p a p e r , t i mp h a g ed i s p l a yt e c h n o l o g y a n dg e n e e n g i

6、n e e r i n ga n t i b o d yt e c l m o l o g yw e r eu s e d t 0 c o n s t r u c ta n d c l o n e a n t i ·C E Ah u m a n a n t i b o d y ．L y m p hn o d e s w e r ec o l l e c t e df r o m5 c a s e so f c o l o r

7、e c t a l c a r c i n o m a p a t i e n t sw i t hh i g he x p r e s s i o nC E A ，a n d t h e i rt o t a lR N A w a se x t r a c t e dw i t hT r i z o lr e a g e n t ．W i t h s e t so f o l i g o —n u c l e o t i d ep r

8、 i m e r s d e s i g n e db yK a n g ，t h eg e n e o fh u m a n i n u n u n o g l o b u l i nF d a n d Kl i g h tc h a i n sw e r ea m p l i f i e d f r o ml y m p hn o d e s ，f o l l o w e db yi t s i s o l a t i o nb y

9、a g a rg e le l e c t r o p h o r e s i sa n d p u r i f i c a t i o n w i t hG e lE x t r a c t i o nM i n iK i t ．T h ep u r i f i e dKl i g h tc h a i n p r o d u c t sw e r ed i g e s t e dw i t hS a d m a d X b a I

10、，t h e nr e c o m b i n e dw i t ht h ep h a g e m i dp 3 M H ．T h ep r o d u c to fl i g a t i o nw a s t r a n s f o r m e di n t oE ．e o l iX L 1 - B l u eb ye l e c t r o t r a n s f o m m t i o n ．T h ec a p a c i t

11、 yo f p h a g ea n t i b o d yl i b r a r yo f K l i g h tc h a i n w a s d e t e r m i n e d ．T h e p h a g e m i d p 3 M H - K o ft h e l i b r a r y o f Kl i g h t c h a i nw a s t h e ne x t r a c t e da n dr e c o n

12、 t h i n e dw i t l lt h e p u r i f i e d F dg e n ep r o d u c t w h i c hd i g e s t e dw i t hS p e Ia n dX h o I ．T h e c a p a c i t yo f p h a g e a n t i b o d y l i b r a r yo f F a b w a s a s s e s s e d ．R e

13、s u l t s P h a g ea n t i b o d yl i b r a r yo f Kl i g h t c h a i n a g a i n s tC E A h a db e e nc o n s t r u c t e d ．t h ec a p a c i t yo f w h i c h h a d1 ．9 ×1 07 m e m b e r s ．A n dt h e i n s e r tf

14、r e q u e n c y o f Kl i g h tc h a i n w a s 8 0 ％d e t e r m i n e db yb a c t e r i a lc o l o n yP C R ．A h u m a n p h a g e a n t i b o d yl i b r a r yo f F a bh a d a l s ob e e nc o n s t r u c t e d ．T h ec a p

15、 a c i t yo f w h i c h h a d 1 ．8 ×1 07 m e m b e r s ．T i l ei n s e r tf r e q u e n c i e s o f xl i g h t’c h a i na n d F d w e r e7 0 ％a n d6 0 ％r e s p e c t i v e l y ．T h er e c o m b i n a n t f r e q u e

16、 n c yo f t h eF a bW a s5 0 ％d e t e r m i n e db yd i g e s t i n gD N A e x t r a c t e d f r o m 1 0 c l o n e sw i t hS a c I a n d S p e I ．C o n c l u s i o n A h u m a np h a g e a n t i b o d y l i b r a r y a g

17、 a i n s t C E Ab a sb e e n c o n s t r u c t e ds u c c e s s f u l l y ．K e yw o r d s ：P h a g ea n t i b o d y l i b r a r y , P o l y m e r a s ec h a i nR e a c t i o n ，C a r c i n o 。e m b r y o m cA n t i g e n