利用導(dǎo)向選擇及噬菌體抗體庫技術(shù)制備人源性抗肝癌抗體.pdf

1、該實(shí)驗(yàn)利用抗肝癌抗體HAb18嵌合輕鏈為模板,導(dǎo)向篩選抗體Fd片段;再以此為基礎(chǔ),篩選出人源輕鏈基因,完成對HAb18的人源化改造.第一部分:人抗體Fab片段基因擴(kuò)增引物的優(yōu)化和鑒定.構(gòu)建噬菌體抗體庫,最重要的一步就是要盡量將所有的抗體基因擴(kuò)增出來,提高庫容量,保持多樣性.根據(jù)V-BASE提供的人抗體可變區(qū)胚系基因,在其家族分類基礎(chǔ)上,根據(jù)FR1區(qū)5'端保守序列重新分組,設(shè)計(jì)特異性的5'端擴(kuò)增引物.Fd3'端引物序列配對于γ鏈、μ鏈的鉸

2、鏈區(qū),輕鏈3'端引物配對于輕鏈(κ、λ)恒定區(qū)3'端.同時(shí)對設(shè)計(jì)引物的匹配情況進(jìn)行系統(tǒng)分析,并應(yīng)用PCR擴(kuò)增和測序反應(yīng)對其擴(kuò)增效果進(jìn)行鑒定.第二部分:噬菌體展示Fab抗體庫構(gòu)建和篩選條件的優(yōu)化.自肝癌患者外周血淋巴細(xì)胞擴(kuò)增人重鏈Fd片段基因,分別克隆入含抗HAb18G嵌合輕鏈的展示載體pComb3和pComb3X,建立人-鼠雜合Fab噬菌體抗體庫(庫容量均>10<'7>pFU).并對抗體庫的擴(kuò)增和篩選條件進(jìn)行優(yōu)化.第三部分:以嵌合抗體

3、輕鏈為摸板導(dǎo)向篩選人源性抗肝癌抗體Fd片段.利用建立的人-鼠雜合Fab噬菌體抗體庫.以大腸桿菌表達(dá)的非融合HAb18GE為抗原進(jìn)行篩選,利用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)的細(xì)菌裂解上清(pⅢ-Fab融合蛋白)進(jìn)行克隆鑒定,并對篩選出的雜合抗體進(jìn)行初步的功能檢測.第四部分:完全人源性抗肝癌抗原HAb18G Fab抗體的篩選及初步功能鑒定.將篩選得到的人Fd基因與人抗體輕鏈基因庫配對,建立完全人源的Fab抗體庫,以大腸桿菌表達(dá)的非融合HAb18GE為抗原