T7噬菌體展示人源抗體庫(kù)篩選雌二醇ScFv抗體.pdf

1、背景:
　　雌二醇(Estradiol，E2)是一種甾體類雌激素，由于可以促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)并且可以提高畜禽瘦肉比，曾經(jīng)廣泛應(yīng)用于畜禽養(yǎng)殖業(yè)，殘留于動(dòng)物組織內(nèi)的雌二醇通過食物鏈進(jìn)入人體，通過干擾內(nèi)分泌系統(tǒng)的功能危害人體健康。因此，發(fā)展簡(jiǎn)便、快速、靈敏的檢測(cè)雌二醇?xì)埩舻姆椒ǚ浅Ｓ斜匾?。與其他檢測(cè)技術(shù)相比，免疫分析方法較適合現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)，但是免疫分析方法的建立首先是制備高特異性抗體，制備雌二醇的高特異性抗體對(duì)于其免疫方法的建立尤為重要。

2、　　目的:
　　制備T7噬菌體尾蛋白P11并制備其多克隆抗體，篩選其單克隆抗體，并將所制備的抗體應(yīng)用于噬菌體展示抗體庫(kù)的篩選，從噬菌體展示天然人源抗體庫(kù)中篩選單鏈抗體(single chain antibody)，并實(shí)現(xiàn)其在大腸桿菌體內(nèi)的表達(dá)，并對(duì)篩選得到的單鏈抗體進(jìn)行性質(zhì)鑒定。
　　方法:
　　1.以T7select10-3b為模板擴(kuò)增P11蛋白基因片段，鑒定其序列的正確性后進(jìn)行原核表達(dá)，大量純化P11蛋白;免疫新西

3、蘭大白兔制備多克隆抗體。
　　2.根據(jù)P11蛋白的氨基酸序列設(shè)計(jì)3條抗原表面多肽，免疫Balb/c小鼠，當(dāng)其效價(jià)不再升高時(shí)進(jìn)行細(xì)胞融合，篩選P11蛋白的單克隆抗體。
　　3.采用固相篩選法和差減篩選法從T7噬菌體展示天然人源抗體庫(kù)中篩選針對(duì)雌二醇的特異性抗體，而后采用噬菌體ELISA篩選針對(duì)雌二醇的特異性重組噬菌體，PCR擴(kuò)增結(jié)合活性較好的重組噬菌體基因序列，構(gòu)建表達(dá)載體pTIG-TRX-ScFv，實(shí)現(xiàn)單鏈抗體的表達(dá)及純化。

4、
　　結(jié)果:
　　1.以T7select10-3b為模板，成功擴(kuò)增出P11蛋白基因片段，測(cè)序結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)相符，成功構(gòu)建表達(dá)載體pTIG-TRX-P11，于大腸桿菌BL21(DE3)進(jìn)行表達(dá)，SDS-PAGE鑒定在約25KDa處有加強(qiáng)帶，與預(yù)期大小相符，且表達(dá)蛋白存在于菌體破碎后上清。
　　2.利用親和層析柱純化P11蛋白，SDS-PAGE鑒定P11蛋白得到了明顯濃縮，大量制備的純度較高的P11蛋白，經(jīng)BCA蛋白

5、定量后用于免疫新西蘭大白兔，六次免疫后采血制得抗P11蛋白抗血清，辛酸-硫酸銨沉淀法純化多克隆抗體，SDS-PAGE鑒定純化后多克隆抗體純度較好，BCA蛋白定量抗體濃度為6.3mg/mL，抗體效價(jià)為1∶32，000。
　　3.經(jīng)HPLC和ESI-MS鑒定合成的三條多肽正確，采用多肽-BSA免疫Balb/c小鼠，其效價(jià)達(dá)到1∶32，000時(shí)，進(jìn)行細(xì)胞融合和單克隆抗體的篩選，最后，篩選得到特異識(shí)別P11-3表位多肽的的P11蛋白單克隆

6、抗體，并制備其腹水型單克隆抗體，采用辛酸-硫酸銨沉淀法純化后經(jīng)SDS-PAGE鑒定，結(jié)果顯示純化效果較好，BCA蛋白定量抗體濃度為3mg/mL，抗體效價(jià)為1∶64，000。
　　4.采用固相篩選和差減篩選的方法對(duì)T7噬菌體人源抗體庫(kù)進(jìn)行了四輪篩選，采用噬菌體ELISA測(cè)定重組噬菌體對(duì)雌二醇的結(jié)合活性，結(jié)果顯示:5株重組噬菌體的結(jié)合活性較好。
　　5.擴(kuò)增完成5株結(jié)合活性較好的重組噬菌體的基因序列，并成功構(gòu)建表達(dá)載體pTIG-

7、TRX-ScFv，SDS-PAGE鑒定在約25KDa處出現(xiàn)表達(dá)加強(qiáng)帶，經(jīng)Westernblot鑒定，ScFv得到了表達(dá)。
　　6.將誘導(dǎo)表達(dá)破碎后上清經(jīng)ELISA和競(jìng)爭(zhēng)ELISA鑒定其對(duì)雌二醇的具有特異性結(jié)合活性且具有競(jìng)爭(zhēng)活性，其中三株較好，我們采用親和層析柱純化此三個(gè)單鏈抗體，獲得了純度較高的純化制品。
　　結(jié)論:
　　1.完善了噬菌體展示抗體庫(kù)平臺(tái):原核表達(dá)P11蛋白成功，并且制備了其多克隆抗體，經(jīng)Western