利用噬菌體展示技術(shù)制備全人抗DR5 scFv抗體.pdf

1、背景：DR5是腫瘤壞死因子TNF相關(guān)的凋亡誘導(dǎo)的配體( TNF-related apoptosis inducing ligand,TRAIL)的一個受體,通過它,TRAIL能誘導(dǎo)細胞發(fā)生凋亡。本實驗室利用DR5抗原制備出能分泌抗DR5的雜交瘤細胞。該抗體為鼠單克隆抗體,但存在一些不足之處,妨限制了其在臨床上的應(yīng)用。隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展,利用基因工程技術(shù)制備出全人抗體,不僅克服了鼠源性的弊端,鼠單抗特異性強、均一性強的優(yōu)點也被保留了下

2、來。其中,全人抗體和人源化抗體的制備技術(shù)包括了以下三個方面:嵌合抗體、CDR移植的抗體和展示技術(shù)與轉(zhuǎn)基因技術(shù)制備的抗體,其中以噬菌體展示技術(shù)可以制備全人抗體,從根本上克服了HAMA(human anti-mouse antibody)反應(yīng),因此,噬菌體抗體庫技術(shù)屬于最理想的制備全人抗體人方式。
　　目的：通過利用噬菌體展示技術(shù)來建立天然噬菌體抗體庫,并從中篩選、制備全人源化抗體。
　　方法：應(yīng)用RT-PCR技術(shù)從人外周血淋巴

3、細胞中獲取人抗體可變區(qū)基因VH、VL,用重疊延伸PCR技術(shù)把連接肽基因(Gly4Ser)3與VH和VL連接成單鏈抗體scFv,利用SfiI和NotⅠ酶切位點,將scFV基因連接入表達載體pcantab-5E中,電轉(zhuǎn)化入大腸桿菌E.coil X-Blue中,利用噬菌體感染,建立初級噬菌體抗體庫。利用菌液PCR來鑒定所建立噬菌體抗體庫的插入率,挑取陽性克隆送北京金唯智生物技術(shù)公司測序,并經(jīng)NCBI-Blast-Ig-Blast,來鑒定噬菌體

4、抗體庫的多樣性。利用固相篩選對所建立的初級噬菌體抗體庫進行四輪富集濃縮,通過ELISA篩選出抗DR5的scFV段陽性克隆。
　　結(jié)果成功的構(gòu)建了庫容量為1.01×107的天然噬菌體抗體庫,經(jīng)測序比對后多樣性良好,并從中篩選出一株表達頻率較高的克隆,和4株與抗TNF-α抗體高度同源的克隆。
　　結(jié)論：成功的篩選出多株全人抗DR5抗體scFv,為抗體蛋白的獲得打下了良好地基礎(chǔ)。并建立起了一個天然全人抗體庫的技術(shù)平臺,為以后篩選針