抗DR5多價(jià)抗體的抗腫瘤作用.pdf

1、背景：
　　 腫瘤壞死因子（Tumor necrosis factor，TNF）相關(guān)的凋亡誘導(dǎo)配體（TNF-related apoptosisinducing ligand，TRAIL）能夠誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞和轉(zhuǎn)化細(xì)胞發(fā)生凋亡。TRAIL誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡是通過其受體TRAIL-R1（Death receptor 4，DR4）及TRAIL-R2（Death receptor5，DR5）介導(dǎo)的，但一些研究發(fā)現(xiàn)TRAIL對(duì)正常的肝細(xì)胞有

2、毒性作用，限制了其在臨床上的應(yīng)用。一些抗TRAIL死亡受體的單克隆抗體具有死亡受體配體的功能活性，能模擬TRAIL的作用，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，而且對(duì)正常人的肝細(xì)胞等沒有毒副作用。本實(shí)驗(yàn)室利用人DR5蛋白制備出分泌抗DR5抗體的雜交瘤細(xì)胞-YM366EC，研究發(fā)現(xiàn)抗DR5抗體交聯(lián)后對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖有明顯的抑制作用，可以誘導(dǎo)對(duì)TRAIL敏感的腫瘤細(xì)胞的凋亡。但是，單克隆抗體存在一些缺陷，如完整的抗體分子量大，而且大部分抗體是鼠源性抗體，應(yīng)用于

3、人體會(huì)產(chǎn)生人抗鼠抗體反應(yīng)（Human anti-mouse antibody，HAMA）等，引起免疫排斥反應(yīng)，阻斷抗體效用的發(fā)揮，因而妨礙了其在臨床上的應(yīng)用。隨著DNA重組技術(shù)的發(fā)展，可以應(yīng)用基因工程技術(shù)制備基因工程抗體，既能保持單克隆抗體均一性，特異性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)，又能克服其鼠源性的弊端。多價(jià)抗體是基因工程抗體之一，近年來人們對(duì)用基因工程技術(shù)生產(chǎn)多價(jià)抗體已進(jìn)行了大量的實(shí)驗(yàn)，取得了迅速地發(fā)展。
　　 目的：
　　 通過構(gòu)建Y

4、M366EC的多價(jià)抗體，使得DR5 發(fā)生交聯(lián)，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。
　　 方法：
　　 應(yīng)用兼并PCR、5′-RACE 技術(shù)從抗DR5 雜交瘤細(xì)胞YM366EC中釣取抗DR5 抗體可變區(qū)基因VL、VH，用連接肽基因（Gly4Ser）3 將VL和VH 連接成單鏈抗體scFv，命名為3D。隨后利用重疊延伸PCR 技術(shù)分別將單鏈抗體scFv 與人IgG3上游鉸鏈區(qū)/p53四價(jià)功能域融合基因、C4 結(jié)合蛋白融合基因連接，得到四價(jià)和

5、八價(jià)抗體融合基因，分別命名為3S及3B。測序正確后，利用Hind Ⅲ和XhoⅠ酶切位點(diǎn)，將三段融合基因分別克隆入真核表達(dá)載體pSecTag2-A中，得到p-3D，p-3S及p-3B，將上述質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染CHO 細(xì)胞，進(jìn)行真核表達(dá)。利用SDS-PAGE和Western blot 實(shí)驗(yàn)鑒定重組蛋白的表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)Ni2+-NTAsuperflow 親和柱純化后，通過MTT 實(shí)驗(yàn)檢測重組抗體對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的影響，利用流式細(xì)胞儀測定其抗腫瘤活性

6、。
　　 結(jié)果：
　　 成功克隆了抗DR5 抗體的可變區(qū)VL、VH基因，構(gòu)建了單鏈、四價(jià)、八價(jià)真核表達(dá)載體；SDS-PAGE和Western blot 實(shí)驗(yàn)證明：p-3D、p-3S及p-3B 質(zhì)粒表達(dá)產(chǎn)物中分別含有約35 KD、40 KD及40 KD大小的特異性蛋白條帶；MTT 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示四價(jià)和八價(jià)重組抗體對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖有明顯地抑制作用，流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示：單鏈抗體沒有抗腫瘤活性，四價(jià)和八價(jià)重組抗體都具有很好的抗腫瘤