抗腫瘤藥物調控非小細胞肺癌細胞中DR5表達的分子機制.pdf

1、研究背景：
　　細胞凋亡通路包括外源性死亡受體介導的信號通路和內源性線粒體信號通路。Death Receptor5(DR5)是TNFR家族的成員，包含一個細胞質內的死亡結構域(DD)。受體三聚化時，死亡結構域可以招募FADD以及pro-caspase8/10形成死亡誘導信號復合體(DISC)。隨后，活化caspase并導致下游效應蛋白的切割。由于DR5對惡性腫瘤細胞有靶向選擇性，很多促凋亡藥物的研究都集中于DR5分子。抗凋亡蛋白c

2、-FLIP可以阻止pro-caspase8組裝入DISC進而抑制caspase8和下游效應蛋白的活化。
　　Bcl-2家族既有抗凋亡蛋白也有促凋亡蛋白，二者的平衡對于內源性凋亡通路的調控十分重要。NOXA是一個只含BH3結構的促凋亡蛋白，是DNA損傷時p53的轉錄靶點。NOXA與化療藥物引起的凋亡有關，其可以與Bcl-2家族的促存活基因Mcl-1相互結合，將Bax從Mcl-1/Bax復合體中置換出來，游離的Bax進而觸發(fā)內源性凋亡

3、通路。NOXA和Mcl-1的結合也能夠促進Mcl-1的蛋白酶體降解，進一步增強線粒體凋亡。
　　很多化療藥物被報道可以誘導腫瘤細胞內質網應激(ERstress)。內質網應激多由錯誤折疊蛋白或未折疊蛋白在內質網腔上的聚集引起，主要包括3條信號通路，分別是蛋白激酶IRE1和PERK介導的信號通路以及轉錄因子ATF6介導的信號通路。
　　錯誤折疊蛋白或未折疊蛋白不能降解時，內質網應激被延長并誘導凋亡。內質網應激可通過多條途徑誘導凋

4、亡，包括pro-caspase12的切割活化、ASK1的活化等。很多研究集中在內質網應激的效應蛋白CHOP上。CHOP是ATF4的下游靶蛋白，可以作為一個含bZIP結構域的轉錄因子調控包括DR5和NOXA在內的凋亡相關基因。內質網應激誘導凋亡的分子機制還需要進一步的研究。
　　腫瘤干細胞與干細胞有很多相似的特性。這類細胞具有自我更新和分化的能力，表達典型的干細胞標記物。腫瘤干細胞對藥物有更強的抗性，被認為是腫瘤細胞的起源。很多報道

5、指出腫瘤干細胞與欠佳的臨床預后有關。因此，腫瘤干細胞有希望成為腫瘤治療可行的靶點。
　　Parthenolide(PTL)是一種來源于植物小白菊的倍半萜烯內酯。PTL因其可抑制NF-κB的活性而廣泛應用與炎癥的治療。研究發(fā)現PTL還具有促進細胞分化、引起細胞周期阻滯、誘導凋亡等功能。關于其促進腫瘤細胞凋亡功能的研究發(fā)現PTL可以觸發(fā)內源性線粒體信號通路，上調細胞內活性氧(ROS)水平，改變Bcl-2家族蛋白的表達。近年來有研究報道

6、PTL可以選擇性的殺傷急性骨髓性白血病干細胞和祖細胞。PTL還可以優(yōu)先抑制乳腺癌類干細胞，但詳細的分子機制未知。
　　細胞內膜系統(tǒng)各個組分之間的物質傳遞常常通過膜泡運輸的方式進行。膜泡運輸是一種高度有組織的定向運輸，馬達蛋白水解ATP提供能量，使有被小泡沿著細胞內的微管被運輸到靶細胞器。
　　膜泡運輸可以分為外排和內吞。其中內吞又可以根據衣被蛋白的不同分為clathrin依賴的內吞和clathrin非依賴的內吞。
　　

7、受體介導的內吞是細胞依靠膜表面受體特異性地攝取細胞外蛋白質或其他化合物的過程。內吞后的受體可以通過再循環(huán)途徑回到質膜，也可以通過晚期內體進入溶酶體降解。內吞運輸可調節(jié)多條信號通路，對細胞的極化、運動、信號傳遞的調控和正常細胞的生長都十分重要。
　　不少研究認為DR5是多種不同細胞中導致死亡的首選受體。DR5也被認為是開發(fā)抗體藥物治療的首要靶點。DR5需要在膜上恰當的表達才能傳遞配體的凋亡信號。有研究發(fā)現，有些乳腺癌等DR5膜表面缺

8、失的細胞系對TRAIL和受體的相關抗體有較強抗性。
　　TRAIL處理時，TRAIL和受體DR5都迅速的內化。TRAIL能夠同時通過clathrin依賴和非依賴的內吞內化。有研究發(fā)現死亡受體的活化導致了clathrin依賴的內吞中幾個蛋白以caspase依賴的方式切割，抑制內吞可增強死亡受體下游caspase的活化，進一步放大了細胞凋亡。
　　但也有資料顯示，有些細胞內clathrin和銜接蛋白AP2的總蛋白水平并不與細胞膜

9、表面DR5直接相關，說明其他元件可能也參與受體的表面缺失過程。關于內吞和運輸途徑中導致細胞膜表面DR5缺失的分子機制需要更多的研究。這些研究對于恰當的抗腫瘤藥物的選擇和設計意義重大。
　　Numb最初在果蠅中被定義為一個重要的細胞命運決定子。Numb蛋白具有調控細胞不對稱分裂、決定細胞命運、內吞、細胞粘附、細胞遷移、特定底物的泛素化等功能。
　　Numb可作為內吞蛋白，在內吞小體、clathrin有被小泡和膜泡中都有分布。內

10、吞的全部線路中，Numb都與被內化的貨物共定位，共同從中間型膜泡運輸至內體。Numb可以通過與Eps15相互結合而被招募入內吞的細胞器，但Numb與Eps15不能定位在同一有被小泡，揭示了Numb可能與其他內吞機制的元件相互結合。
　　研究方法：
　　1.腫瘤細胞培養(yǎng);
　　2.SRB和MTT比色法檢測腫瘤細胞存活率;
　　3.流式細胞術檢測細胞周期
　　4.WesternBlot檢測細胞內相關蛋白的表達;

11、
　　5.流式細胞術檢測細胞凋亡;
　　6.RNAi抑制相關基因的表達;
　　7.基因克隆;
　　8.流式細胞術檢測膜表面DR5;
　　9.基因過表達檢測對相關蛋白的影響;
　　10.免疫熒光檢測膜表面DR5;
　　11.免疫沉淀檢測蛋白相互作用。
　　實驗結果：
　　1.PTL可明顯抑制非小細胞肺癌細胞Calu-1、H1792、A549、H1299、H157和H460的存活率，這種

12、抑制作用具有濃度依賴性;
　　2.PTL以濃度依賴方式誘導A549細胞G0/G1細胞周期阻滯，誘導H1792細胞G2/M細胞周期阻滯;
　　3.PTL在A549、Calu-1、H1299和H1792中以濃度和時間依賴的方式激活了促凋亡蛋白caspase的級聯反應;
　　4.PTL以濃度和時間依賴的方式促進了A549、Calu-1、H1299和H1792細胞中死亡受體DR5的表達，敲除DR5可抑制PTL誘導的caspas

13、e級聯反應和細胞凋亡;
　　5.PTL抑制了A549、Calu-1、H1299、H1792和H157細胞中抗凋亡蛋白c-FLIP的表達，這種抑制作用具有濃度和時間依賴性，過表達c-FLIP可抑制PTL誘導的caspase級聯反應和細胞凋亡;
　　6.PTL以濃度和時間依賴的方式促進了A549、Calu-1、H1299和H1792細胞中促凋亡蛋白NOXA的表達，抑制抗凋亡蛋白Mcl-1的表達，敲除NOXA可以上調Mcl-1，抑

14、制PTL誘導的caspase級聯反應和細胞凋亡;
　　7.PTL上調內質網應激通路中的效應蛋白ATF4和CHOP的表達，這種上調具有濃度和時間依賴性，敲除ATF4抑制CHOP的表達和PTL誘導的caspase級聯反應，敲除CHOP抑制了DR5和NOXA的表達，抑制了PTL誘導的caspase級聯反應;
　　8.PTL以濃度和時間依賴的方式上調了內質網應激通路中IRE1α、Bip、p-eIF2α的表達;
　　9.A549

15、細胞中E-cad缺失上調干細胞標記物Oct4和Sox2表達;
　　10.相同濃度PTL對A549/shE-cad細胞存活有更強的抑制作用，并在A549/shE-cad細胞中誘導更強的caspase級聯反應;
　　11.PTL誘導的促凋亡蛋白NOXA的上調、抗凋亡蛋白c-FLIP和Mcl-1的下調在A549/shE-cad細胞增強;
　　12.PTL誘導的內質網應激相關蛋白p-eIF2α、ATF4和CHOP的上調在A54

16、9/shE-cad細胞增強，敲除CHOP可抑制PTL誘導的NOXA的上調以及caspase3和PARP的切割;
　　13.SAHA以濃度梯度依賴的方式激活非小細胞肺癌細胞A549，H1792caspase級聯反應;
　　14.SAHA以濃度梯度和時間梯度依賴的方式上調A549、Calu-1、H1299和H1792細胞中DR5的表達，敲除DR5對SAHA誘導的caspase級聯反應有更強的抑制作用;
　　15.抗腫瘤藥物

17、SAHA和PEM處理可上調A549和H1792細胞膜上的DR5;
　　16.Bafilomycin-A1和MG132可增強PEM誘導的A549細胞中DR5的表達，E-64d和MG132可增強SAHA誘導的A549和H1792細胞中DR5的表達;
　　17.SAHA、PEM都以濃度梯度依賴的方式下調非小細胞肺癌A549和H1792細胞中Numb和NumbL的表達，
　　18.敲除Numb和NumbL可增強抗腫瘤藥物誘導的

18、DR5表達和caspase級聯反應，過表達Numb和NumbL可抑制抗腫瘤藥物誘導的DR5表達和caspase級聯反應;
　　19.過表達Numb和NumbL可下調細胞膜上的DR5;
　　20.Numb和NumbL可以與DR5相互結合。
　　結論：
　　1.PTL具有抗腫瘤作用，其發(fā)揮抗腫瘤作用通過誘導細胞凋亡和細胞周期阻滯;
　　2.C-FLIP和死亡受體DR5在PTL誘導的外源性凋亡中發(fā)揮重要作用;

19、r>　　3.PTL通過NOXA-Mcl-1軸誘導內源性凋亡;
　　4.PTL通過觸發(fā)內質網應激誘導細胞凋亡;
　　5.PTL在類腫瘤干細胞中誘導更強的內質網應激和凋亡;
　　6.抗腫瘤藥物SAHA、PEM通過上調死亡受體DR5的表達誘導非小細胞肺癌細胞凋亡;
　　7.SAHA和PEM上調非小細胞肺癌細胞膜表面DR5，抑制溶酶體途徑和蛋白酶體途徑降解可增強抗腫瘤藥物誘導的DR5表達;
　　8.抗腫瘤藥物通過抑

20、制內吞蛋白Numb和NumbL上調DR5和凋亡;
　　9.過表達Numb和NumbL減少DR5在膜上的表達;
　　10.Numb與NumbL可以與DR5相互結合。
　　綜上所述，本研究發(fā)現PTL通過誘導細胞凋亡和周期阻滯發(fā)揮抗腫瘤作用，并且提出了PTL誘導非小細胞肺癌細胞凋亡的分子機制:PTL激活內質網應激，上調ATF4和CHOP的表達;CHOP作為轉錄因子上調死亡受體DR5和促凋亡蛋白NOXA的表達，從而分別誘導外源

21、性和內源性的細胞凋亡?？沟蛲龅鞍譪-FLIP參與了PTL誘導的外源性細胞凋亡。本研究還發(fā)現PTL在類腫瘤細胞中誘導更強的內質網應激和凋亡，為PTL選擇性殺傷作用提供了可能的分子機制。
　　內吞蛋白Numb和NumbL可以與死亡受體DR5結合。抗腫瘤藥物通過下調Numb和NumbL，上調細胞內總的和膜表面DR5，進而誘導非小細胞肺癌細胞凋亡。抑制溶酶體途徑和蛋白酶體途徑降解增強抗腫瘤藥物誘導的DR5表達。Numb和NumbL可能通過