抗腫瘤藥物調(diào)控非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中DR5表達(dá)的分子機(jī)制.pdf

1、研究背景：
　　細(xì)胞凋亡通路包括外源性死亡受體介導(dǎo)的信號通路和內(nèi)源性線粒體信號通路。Death Receptor5(DR5)是TNFR家族的成員，包含一個(gè)細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的死亡結(jié)構(gòu)域(DD)。受體三聚化時(shí)，死亡結(jié)構(gòu)域可以招募FADD以及pro-caspase8/10形成死亡誘導(dǎo)信號復(fù)合體(DISC)。隨后，活化caspase并導(dǎo)致下游效應(yīng)蛋白的切割。由于DR5對惡性腫瘤細(xì)胞有靶向選擇性，很多促凋亡藥物的研究都集中于DR5分子?？沟蛲龅鞍譪

2、-FLIP可以阻止pro-caspase8組裝入DISC進(jìn)而抑制caspase8和下游效應(yīng)蛋白的活化。
　　Bcl-2家族既有抗凋亡蛋白也有促凋亡蛋白，二者的平衡對于內(nèi)源性凋亡通路的調(diào)控十分重要。NOXA是一個(gè)只含BH3結(jié)構(gòu)的促凋亡蛋白，是DNA損傷時(shí)p53的轉(zhuǎn)錄靶點(diǎn)。NOXA與化療藥物引起的凋亡有關(guān)，其可以與Bcl-2家族的促存活基因Mcl-1相互結(jié)合，將Bax從Mcl-1/Bax復(fù)合體中置換出來，游離的Bax進(jìn)而觸發(fā)內(nèi)源性凋亡

3、通路。NOXA和Mcl-1的結(jié)合也能夠促進(jìn)Mcl-1的蛋白酶體降解，進(jìn)一步增強(qiáng)線粒體凋亡。
　　很多化療藥物被報(bào)道可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ERstress)。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激多由錯(cuò)誤折疊蛋白或未折疊蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔上的聚集引起，主要包括3條信號通路，分別是蛋白激酶IRE1和PERK介導(dǎo)的信號通路以及轉(zhuǎn)錄因子ATF6介導(dǎo)的信號通路。
　　錯(cuò)誤折疊蛋白或未折疊蛋白不能降解時(shí)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激被延長并誘導(dǎo)凋亡。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可通過多條途徑誘導(dǎo)凋

4、亡，包括pro-caspase12的切割活化、ASK1的活化等。很多研究集中在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的效應(yīng)蛋白CHOP上。CHOP是ATF4的下游靶蛋白，可以作為一個(gè)含bZIP結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控包括DR5和NOXA在內(nèi)的凋亡相關(guān)基因。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)凋亡的分子機(jī)制還需要進(jìn)一步的研究。
　　腫瘤干細(xì)胞與干細(xì)胞有很多相似的特性。這類細(xì)胞具有自我更新和分化的能力，表達(dá)典型的干細(xì)胞標(biāo)記物。腫瘤干細(xì)胞對藥物有更強(qiáng)的抗性，被認(rèn)為是腫瘤細(xì)胞的起源。很多報(bào)道

5、指出腫瘤干細(xì)胞與欠佳的臨床預(yù)后有關(guān)。因此，腫瘤干細(xì)胞有希望成為腫瘤治療可行的靶點(diǎn)。
　　Parthenolide(PTL)是一種來源于植物小白菊的倍半萜烯內(nèi)酯。PTL因其可抑制NF-κB的活性而廣泛應(yīng)用與炎癥的治療。研究發(fā)現(xiàn)PTL還具有促進(jìn)細(xì)胞分化、引起細(xì)胞周期阻滯、誘導(dǎo)凋亡等功能。關(guān)于其促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡功能的研究發(fā)現(xiàn)PTL可以觸發(fā)內(nèi)源性線粒體信號通路，上調(diào)細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)水平，改變Bcl-2家族蛋白的表達(dá)。近年來有研究報(bào)道

6、PTL可以選擇性的殺傷急性骨髓性白血病干細(xì)胞和祖細(xì)胞。PTL還可以優(yōu)先抑制乳腺癌類干細(xì)胞，但詳細(xì)的分子機(jī)制未知。
　　細(xì)胞內(nèi)膜系統(tǒng)各個(gè)組分之間的物質(zhì)傳遞常常通過膜泡運(yùn)輸?shù)姆绞竭M(jìn)行。膜泡運(yùn)輸是一種高度有組織的定向運(yùn)輸，馬達(dá)蛋白水解ATP提供能量，使有被小泡沿著細(xì)胞內(nèi)的微管被運(yùn)輸?shù)桨屑?xì)胞器。
　　膜泡運(yùn)輸可以分為外排和內(nèi)吞。其中內(nèi)吞又可以根據(jù)衣被蛋白的不同分為clathrin依賴的內(nèi)吞和clathrin非依賴的內(nèi)吞。
　　

7、受體介導(dǎo)的內(nèi)吞是細(xì)胞依靠膜表面受體特異性地?cái)z取細(xì)胞外蛋白質(zhì)或其他化合物的過程。內(nèi)吞后的受體可以通過再循環(huán)途徑回到質(zhì)膜，也可以通過晚期內(nèi)體進(jìn)入溶酶體降解。內(nèi)吞運(yùn)輸可調(diào)節(jié)多條信號通路，對細(xì)胞的極化、運(yùn)動(dòng)、信號傳遞的調(diào)控和正常細(xì)胞的生長都十分重要。
　　不少研究認(rèn)為DR5是多種不同細(xì)胞中導(dǎo)致死亡的首選受體。DR5也被認(rèn)為是開發(fā)抗體藥物治療的首要靶點(diǎn)。DR5需要在膜上恰當(dāng)?shù)谋磉_(dá)才能傳遞配體的凋亡信號。有研究發(fā)現(xiàn)，有些乳腺癌等DR5膜表面缺

8、失的細(xì)胞系對TRAIL和受體的相關(guān)抗體有較強(qiáng)抗性。
　　TRAIL處理時(shí)，TRAIL和受體DR5都迅速的內(nèi)化。TRAIL能夠同時(shí)通過clathrin依賴和非依賴的內(nèi)吞內(nèi)化。有研究發(fā)現(xiàn)死亡受體的活化導(dǎo)致了clathrin依賴的內(nèi)吞中幾個(gè)蛋白以caspase依賴的方式切割，抑制內(nèi)吞可增強(qiáng)死亡受體下游caspase的活化，進(jìn)一步放大了細(xì)胞凋亡。
　　但也有資料顯示，有些細(xì)胞內(nèi)clathrin和銜接蛋白AP2的總蛋白水平并不與細(xì)胞膜

9、表面DR5直接相關(guān)，說明其他元件可能也參與受體的表面缺失過程。關(guān)于內(nèi)吞和運(yùn)輸途徑中導(dǎo)致細(xì)胞膜表面DR5缺失的分子機(jī)制需要更多的研究。這些研究對于恰當(dāng)?shù)目鼓[瘤藥物的選擇和設(shè)計(jì)意義重大。
　　Numb最初在果蠅中被定義為一個(gè)重要的細(xì)胞命運(yùn)決定子。Numb蛋白具有調(diào)控細(xì)胞不對稱分裂、決定細(xì)胞命運(yùn)、內(nèi)吞、細(xì)胞粘附、細(xì)胞遷移、特定底物的泛素化等功能。
　　Numb可作為內(nèi)吞蛋白，在內(nèi)吞小體、clathrin有被小泡和膜泡中都有分布。內(nèi)

10、吞的全部線路中，Numb都與被內(nèi)化的貨物共定位，共同從中間型膜泡運(yùn)輸至內(nèi)體。Numb可以通過與Eps15相互結(jié)合而被招募入內(nèi)吞的細(xì)胞器，但Numb與Eps15不能定位在同一有被小泡，揭示了Numb可能與其他內(nèi)吞機(jī)制的元件相互結(jié)合。
　　研究方法：
　　1.腫瘤細(xì)胞培養(yǎng);
　　2.SRB和MTT比色法檢測腫瘤細(xì)胞存活率;
　　3.流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期
　　4.WesternBlot檢測細(xì)胞內(nèi)相關(guān)蛋白的表達(dá);

11、
　　5.流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡;
　　6.RNAi抑制相關(guān)基因的表達(dá);
　　7.基因克隆;
　　8.流式細(xì)胞術(shù)檢測膜表面DR5;
　　9.基因過表達(dá)檢測對相關(guān)蛋白的影響;
　　10.免疫熒光檢測膜表面DR5;
　　11.免疫沉淀檢測蛋白相互作用。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　1.PTL可明顯抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞Calu-1、H1792、A549、H1299、H157和H460的存活率，這種

12、抑制作用具有濃度依賴性;
　　2.PTL以濃度依賴方式誘導(dǎo)A549細(xì)胞G0/G1細(xì)胞周期阻滯，誘導(dǎo)H1792細(xì)胞G2/M細(xì)胞周期阻滯;
　　3.PTL在A549、Calu-1、H1299和H1792中以濃度和時(shí)間依賴的方式激活了促凋亡蛋白caspase的級聯(lián)反應(yīng);
　　4.PTL以濃度和時(shí)間依賴的方式促進(jìn)了A549、Calu-1、H1299和H1792細(xì)胞中死亡受體DR5的表達(dá)，敲除DR5可抑制PTL誘導(dǎo)的caspas

13、e級聯(lián)反應(yīng)和細(xì)胞凋亡;
　　5.PTL抑制了A549、Calu-1、H1299、H1792和H157細(xì)胞中抗凋亡蛋白c-FLIP的表達(dá)，這種抑制作用具有濃度和時(shí)間依賴性，過表達(dá)c-FLIP可抑制PTL誘導(dǎo)的caspase級聯(lián)反應(yīng)和細(xì)胞凋亡;
　　6.PTL以濃度和時(shí)間依賴的方式促進(jìn)了A549、Calu-1、H1299和H1792細(xì)胞中促凋亡蛋白NOXA的表達(dá)，抑制抗凋亡蛋白Mcl-1的表達(dá)，敲除NOXA可以上調(diào)Mcl-1，抑

14、制PTL誘導(dǎo)的caspase級聯(lián)反應(yīng)和細(xì)胞凋亡;
　　7.PTL上調(diào)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路中的效應(yīng)蛋白ATF4和CHOP的表達(dá)，這種上調(diào)具有濃度和時(shí)間依賴性，敲除ATF4抑制CHOP的表達(dá)和PTL誘導(dǎo)的caspase級聯(lián)反應(yīng)，敲除CHOP抑制了DR5和NOXA的表達(dá)，抑制了PTL誘導(dǎo)的caspase級聯(lián)反應(yīng);
　　8.PTL以濃度和時(shí)間依賴的方式上調(diào)了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路中IRE1α、Bip、p-eIF2α的表達(dá);
　　9.A549

15、細(xì)胞中E-cad缺失上調(diào)干細(xì)胞標(biāo)記物Oct4和Sox2表達(dá);
　　10.相同濃度PTL對A549/shE-cad細(xì)胞存活有更強(qiáng)的抑制作用，并在A549/shE-cad細(xì)胞中誘導(dǎo)更強(qiáng)的caspase級聯(lián)反應(yīng);
　　11.PTL誘導(dǎo)的促凋亡蛋白NOXA的上調(diào)、抗凋亡蛋白c-FLIP和Mcl-1的下調(diào)在A549/shE-cad細(xì)胞增強(qiáng);
　　12.PTL誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白p-eIF2α、ATF4和CHOP的上調(diào)在A54

16、9/shE-cad細(xì)胞增強(qiáng)，敲除CHOP可抑制PTL誘導(dǎo)的NOXA的上調(diào)以及caspase3和PARP的切割;
　　13.SAHA以濃度梯度依賴的方式激活非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549，H1792caspase級聯(lián)反應(yīng);
　　14.SAHA以濃度梯度和時(shí)間梯度依賴的方式上調(diào)A549、Calu-1、H1299和H1792細(xì)胞中DR5的表達(dá)，敲除DR5對SAHA誘導(dǎo)的caspase級聯(lián)反應(yīng)有更強(qiáng)的抑制作用;
　　15.抗腫瘤藥物

17、SAHA和PEM處理可上調(diào)A549和H1792細(xì)胞膜上的DR5;
　　16.Bafilomycin-A1和MG132可增強(qiáng)PEM誘導(dǎo)的A549細(xì)胞中DR5的表達(dá)，E-64d和MG132可增強(qiáng)SAHA誘導(dǎo)的A549和H1792細(xì)胞中DR5的表達(dá);
　　17.SAHA、PEM都以濃度梯度依賴的方式下調(diào)非小細(xì)胞肺癌A549和H1792細(xì)胞中Numb和NumbL的表達(dá)，
　　18.敲除Numb和NumbL可增強(qiáng)抗腫瘤藥物誘導(dǎo)的

18、DR5表達(dá)和caspase級聯(lián)反應(yīng)，過表達(dá)Numb和NumbL可抑制抗腫瘤藥物誘導(dǎo)的DR5表達(dá)和caspase級聯(lián)反應(yīng);
　　19.過表達(dá)Numb和NumbL可下調(diào)細(xì)胞膜上的DR5;
　　20.Numb和NumbL可以與DR5相互結(jié)合。
　　結(jié)論：
　　1.PTL具有抗腫瘤作用，其發(fā)揮抗腫瘤作用通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期阻滯;
　　2.C-FLIP和死亡受體DR5在PTL誘導(dǎo)的外源性凋亡中發(fā)揮重要作用;

19、r>　　3.PTL通過NOXA-Mcl-1軸誘導(dǎo)內(nèi)源性凋亡;
　　4.PTL通過觸發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡;
　　5.PTL在類腫瘤干細(xì)胞中誘導(dǎo)更強(qiáng)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和凋亡;
　　6.抗腫瘤藥物SAHA、PEM通過上調(diào)死亡受體DR5的表達(dá)誘導(dǎo)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞凋亡;
　　7.SAHA和PEM上調(diào)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞膜表面DR5，抑制溶酶體途徑和蛋白酶體途徑降解可增強(qiáng)抗腫瘤藥物誘導(dǎo)的DR5表達(dá);
　　8.抗腫瘤藥物通過抑

20、制內(nèi)吞蛋白Numb和NumbL上調(diào)DR5和凋亡;
　　9.過表達(dá)Numb和NumbL減少DR5在膜上的表達(dá);
　　10.Numb與NumbL可以與DR5相互結(jié)合。
　　綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)PTL通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和周期阻滯發(fā)揮抗腫瘤作用，并且提出了PTL誘導(dǎo)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制:PTL激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，上調(diào)ATF4和CHOP的表達(dá);CHOP作為轉(zhuǎn)錄因子上調(diào)死亡受體DR5和促凋亡蛋白NOXA的表達(dá)，從而分別誘導(dǎo)外源

21、性和內(nèi)源性的細(xì)胞凋亡?？沟蛲龅鞍譪-FLIP參與了PTL誘導(dǎo)的外源性細(xì)胞凋亡。本研究還發(fā)現(xiàn)PTL在類腫瘤細(xì)胞中誘導(dǎo)更強(qiáng)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和凋亡，為PTL選擇性殺傷作用提供了可能的分子機(jī)制。
　　內(nèi)吞蛋白Numb和NumbL可以與死亡受體DR5結(jié)合。抗腫瘤藥物通過下調(diào)Numb和NumbL，上調(diào)細(xì)胞內(nèi)總的和膜表面DR5，進(jìn)而誘導(dǎo)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞凋亡。抑制溶酶體途徑和蛋白酶體途徑降解增強(qiáng)抗腫瘤藥物誘導(dǎo)的DR5表達(dá)。Numb和NumbL可能通過