CHAF1A基因在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中的功能和分子機(jī)制研究.pdf

1、研究目的：
　　1.檢測CHAF1A在非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）組織及癌旁組織中的表達(dá)情況，闡明CHAF1A在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)；并研究CHAF1A與部分臨床參數(shù)的關(guān)系；
　　2.檢測CHAF1A基因在人肺癌細(xì)胞株A549、H1299和H1975中的表達(dá)；應(yīng)用siRNA干擾技術(shù)進(jìn)行慢病毒包裝并感染目的細(xì)胞，敲減CHAF1A基因，干擾CHAF1A基因表達(dá)，觀察細(xì)胞的生長、增殖及凋亡；
　　3.探討CHAF1A基因敲減后

2、非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞周期的變化；
　　4.檢測敲減CHAF1A基因后，非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞下游靶基因表達(dá)的變化。探尋具有非小細(xì)胞肺癌生長、增殖、轉(zhuǎn)移潛能的預(yù)測性生物標(biāo)志物及其作用機(jī)制，為肺癌的診治探索新的思路。
　　研究方法：
　　1.收集2010年12月至2016年1月在山西醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院胸外科行手術(shù)切除，并且全部經(jīng)過病理診斷證實(shí)為非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）的患者218例，行免疫組化、免熒光PCR檢測，闡明CHAF1A

3、在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)；分析CHAF1A與部分臨床參數(shù)的關(guān)系；
　　2.將包裝含有CHAF1A基因RNA干擾靶點(diǎn)序列及空載對照慢病毒分別感染H1299細(xì)胞，采用倒置顯微鏡觀察綠色熒光蛋白表達(dá)情況，觀察病毒感染率；Realtime PCR法檢測肺癌細(xì)胞系H1299細(xì)胞CHAF1A的表達(dá)變化；
　　3.MTT法、Cellomics細(xì)胞計(jì)數(shù)及細(xì)胞克隆形成試驗(yàn)，檢測敲減CHAF1A基因后，肺癌H1299細(xì)胞的增殖；
　　4.C

4、HAF1A基因敲減后，采用流式細(xì)胞技術(shù)檢測非小細(xì)胞肺癌H1299細(xì)胞周期的變化及細(xì)胞凋亡；
　　5.Western blot技術(shù)檢測CHAF1A基因敲減后非小細(xì)胞肺癌H1299細(xì)胞下游靶基因p21、p27、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶2（CDK2）、Skp2、cyclin D1等的表達(dá)水平。
　　研究結(jié)果：
　　1.免疫組化結(jié)果顯示:CHAF1A主要在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞胞漿和細(xì)胞膜中表達(dá)，與正常肺組織相比，CHAF1A在非小細(xì)

5、胞肺癌組織中表達(dá)明顯上調(diào)；CHAF1A的表達(dá)量與非小細(xì)胞肺癌患者性別、年齡的關(guān)系無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而與吸煙與否、腫瘤大小、及腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)；CHAF1A基因在A549、H1299和H1975細(xì)胞中mRNA的ΔCt值均小于9.6，表達(dá)豐度高；
　　2.定量PCR結(jié)果顯示:siRNA慢病毒感染后，H1299細(xì)胞中CHAF1A基因在mRNA水平的表達(dá)量受到抑制（p<0.05），敲減效率達(dá)到84.7％；
　　3.Cellomics計(jì)數(shù)表明

6、:CHAF1A基因敲減后細(xì)胞數(shù)量明顯降低(162±10 vs.523±8 cells/field,P<0.05)；克隆形成實(shí)驗(yàn)顯示:CHAF1A基因敲減后H1299細(xì)胞形成的克隆數(shù)顯著低于對照組（21±9 vs.84±12 colonies/dish,P<0.05；MTT檢測結(jié)果顯示:與對照組相比CHAF1A基因敲減后細(xì)胞增殖、生長能力明顯下降（P<0.05）；相比對照組CHAF1A基因敲減后H1299細(xì)胞凋亡數(shù)增多（P<0.05）；<

7、br>　　4.與對照組相比CHAF1A基因敲減后H1299處于G1期的細(xì)胞減少(P<0.05)，處于S期的細(xì)胞增多(P<0.05)，處于G2/M期的細(xì)胞顯著減少(P<0.05)。表明CHAF1A基因敲減后H1299出現(xiàn)了S期向G2/M期的轉(zhuǎn)化減少，細(xì)胞阻滯于S期；
　　5.Western blot分析了解CHAF1A基因敲減后下游基因蛋白的變化，結(jié)果顯示:H1299細(xì)胞CHAF1A基因敲減后cyclin D1、CDK2、Skp2表

8、達(dá)下調(diào)，p21和p27的表達(dá)上調(diào)。
　　結(jié)論：
　　1.和正常組織相比:CHAF1A mRNA、蛋白在非小細(xì)胞肺癌組織中表達(dá)上調(diào)；肺癌細(xì)胞株A549、H1299和H1975中CHAF1A基因表達(dá)明顯。
　　2.CHAF1A過度表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌患者臨床病理密切相關(guān)，CHAF1A可能是非小細(xì)胞肺癌預(yù)后的一個(gè)重要指標(biāo)。
　　3.本研究采用siRNA干擾技術(shù)，進(jìn)行慢病毒包裝并感染目的細(xì)胞，沉默CHAF1A基因，降低H1

9、299細(xì)胞mRNA的表達(dá)；成功建立了穩(wěn)定的CHAF1A-siRNA細(xì)胞株。
　　4.在非小細(xì)胞肺癌H1299，敲減CHAF1A基因使細(xì)胞增殖受抑制，克隆形成顯著減少；且H1299細(xì)胞凋亡明顯增加。
　　5.CHAF1A基因敲減后H1299細(xì)胞S期向G2/M期的轉(zhuǎn)化減少，細(xì)胞阻滯于S期。
　　6.敲減H1299細(xì)胞CHAF1A基因后，cyclin D1、CDK2、Skp2表達(dá)下調(diào)，p21和p27的表達(dá)上調(diào)，抑制DNA的合