Id4基因在非小細胞肺癌順鉑耐藥中的作用及相關機制研究.pdf

1、研究背景:
　　肺癌已經發(fā)展成為了當今全球最為常見的惡性腫瘤之一，它嚴重侵害了人類的身體健康，并且其發(fā)病率和死亡率在近些年來均表現(xiàn)出了上升的趨勢。肺癌按照組織病理類型劃分為了非小細胞肺癌(NSCLC)和小細胞肺癌(SCLC)兩大類，其中非小細胞肺癌病理類型占所有確診肺癌的患者中的80％～85％，其余病理類型為小細胞肺癌。因為常見的早期肺癌通常沒有典型的臨床癥狀，而且多數(shù)易感人群并沒有接受過定期的肺部體檢，所以僅僅只有16％的患者在

2、疾病的早期階段被診斷，而大多數(shù)的肺癌患者錯失了早期診斷的最佳時期。肺癌臨床分期中的Ⅰ期和Ⅱ期非小細胞肺癌患者大多有機會接受手術治療。然而，多數(shù)肺癌患者被確診時，疾病往往已進展為Ⅲ或Ⅳ期，這些晚期肺癌患者中的絕大多數(shù)已經失去接受手術治療的機會。盡管采用手術方式切除腫瘤病灶仍然是目前治療肺癌的首選方式，但是為了增加手術切除的幾率和減少復發(fā)轉移，一部分擬接受手術的患者還需同時采用術前或術后輔助化療方案。而絕大多數(shù)臨床分期被劃為Ⅲ期和Ⅳ期的非小

3、細胞肺癌患者均需要接受化療。對于這些需要化療的肺癌患者來說，含鉑的聯(lián)合用藥方案是目前臨床公認的治療中晚期非小細胞肺癌化療一線方案。鉑類藥物中應用最廣泛的是順鉑，但是在臨床治療中普遍存在著原發(fā)性和獲得性的順鉑耐藥現(xiàn)象，這嚴重削弱了順鉑對腫瘤細胞的殺傷效果。自從順鉑的耐藥現(xiàn)象出現(xiàn)以來，廣大研究者致力于探索順鉑耐藥性產生的原因，并且提出了一系列有關順鉑耐藥的分子生物學機制，研究發(fā)現(xiàn)順鉑耐藥相關機制是由多因素、多分子共同參的復雜過程，主要包括了

4、細胞凋亡通路的異常變化，DNA修復作用在細胞中的異常，藥物在細胞中蓄積減少，藥物去活作用增加，以及藥物作用相關信號通路的調控異常等。但是到現(xiàn)在為止，在腫瘤治療過程中出現(xiàn)的順鉑耐藥現(xiàn)象依然沒有得到解決，其具體的分子生物學機制尚未明確。因此，我們通過對肺癌順鉑耐藥相關機制進行探索，進而找到逆轉耐藥現(xiàn)象的方法，這對克服化療耐藥有著重要的臨床意義。
　　研究目的:
　　我們的研究通過非標記定量蛋白質組學質譜的方法在肺腺癌順鉑敏感細胞

5、與耐順鉑細胞中篩選出一系列的差異蛋白，并選取其中特異性的Id4蛋白進行研究，明確其上游基因及下游信號通路。進一步探索Id4基因在肺鱗癌及大細胞肺癌中與順鉑敏感性的關系，從而為攻克非小細胞肺癌治療中廣泛存在的順鉑耐藥現(xiàn)象提供新的分子生物學依據(jù)。
　　研究方法:
　　1.本研究通過非標記定量蛋白質譜組學技術對人肺腺癌細胞株和其親本耐順鉑細胞株分別進行檢測。篩選并分析兩親本細胞株中的差異蛋白及信號通路。并從中挑選出具有顯著差異的I

6、d4蛋白進行深度探索。
　　2.對蛋白質譜組學篩選出的Id4蛋白進行驗證。我們應用Western blot技術驗證Id4在兩個親本細胞株中蛋白水平的差異。應用Real-time PCR檢測Id4在下游mRNA水平差異。
　　3.使用CCK8方法來測定腫瘤細胞對順鉑藥物的敏感性。流式細胞技術檢測兩親本腫瘤細胞在順鉑刺激下出現(xiàn)的凋亡率。
　　4.我們構建了Id4質粒，并將其轉染入順鉑敏感細胞中。分別檢測Id4表達升高后細胞

7、耐藥性、凋亡率和遷移能力的變化。以Id4基因序列作為模板，合成與能與Id4基因特異性結合的小干擾RNA。觀察干擾Id4基因表達對細胞耐藥性以及凋亡率的影響。
　　5.對蛋白質譜篩選結果進行深度分析。找出可能與Id4有關并參與順鉑耐藥的相關信號通路。對可能參與耐藥的信號通路進行驗證.。
　　6.探索Id4在肺鱗癌和肺大細胞癌順鉑敏感性中產生的影響。分別在肺鱗癌H520細胞和肺大細胞癌H460細胞中轉染Id4載體，觀察上調Id4

8、基因對兩細胞順鉑敏感性和凋亡率的改變。進一步明確相關信號通路的改變。
　　研究結果:
　　1.通過Label-free非標記定量蛋白質組學技術對A549和A549/DDP細胞進行差異蛋白的檢測，篩選出蛋白4140個，其中在A549中特有的蛋白886個，A549/DDP中特有的蛋白800個，A549和A549/DDP共有蛋白2586個，A549較A549/DDP表達上調蛋白718個，A549較A549/DDP表達下調蛋白281

9、個。其中Id4蛋白在A549/DDP細胞中較A549細胞上調6倍。
　　2.驗證蛋白質譜結果:A549/DDP細胞中Id4下游的mRNA量和蛋白表達水平明顯高于A549敏感細胞株(P＜0.05)。耐順鉑細胞株的半數(shù)抑制濃度為16.64±1.15μg/ml，顯著高與敏感細胞的1.67±1.23μg/ml(P＜0.01)。而耐順鉑細胞株的凋亡率為10.06±2.32％，明顯少于A549細胞的20.13±2.85％(P＜0.05)。驗證

10、結果與質譜組學篩選出的差異結果相吻合。
　　3.在A549細胞中上調Id4基因可以增加腫瘤細胞對順鉑耐藥性。在敏感細胞株中上調Id4基因后，發(fā)現(xiàn)Id4基因下游的mRNA水平以及蛋白表達量顯著升高(P＜0.05，P＜0.05)、腫瘤細胞半數(shù)抑制濃度由2.02±0.45μg/ml上升至7.11±1.59μg/ml(P＜0.05)、凋亡率下降從19.49±2.45％下降到13.09±2.19％(P＜0.05)。然而上調Id4基因的表達對

11、A549細胞的遷移及侵襲能力無影響(P＞0.05)。
　　4.A549/DDP細胞中的Id4基因被小干擾RNA沉默后可使腫瘤細胞對順鉑敏感性增加。在A549/DDP細胞中下調Id4基因后，Id4基因的下游的mRNA水平和蛋白表達量明顯降低(P＜0.01，P＜0.05)、細胞半數(shù)抑制濃度由16.73±2.37μg/ml下降至9.31±1.86μg/ml(P＜0.05)、細胞凋亡率明顯由10.21±2.35％升至15.61±2.44％

12、(P＜0.05)。
　　5.A549/DDP細胞中磷酸化P38MAPK蛋白的表達量明顯高于其親本A549細胞(P＜0.05)。轉染Id4質粒使A549細胞中磷酸化P38MAPK蛋白表達明顯增高(P＜0.05)。當用小干擾RNA沉默Id4基因后，A549/DDP細胞中磷酸化P38MAPK蛋白表達量也隨之下降(P＜0.05)。當P38MAPK通路被SB202190(P38MAPK抑制劑)抑制阻斷后，A549/DDP細胞中磷酸化P38M

13、APK被抑制(P＜0.05)、IC50由16.64±1.15μg/ml下降到12.14±1.83μg/ml，(P＜0.05)、細胞凋亡率由(10.06±2.32)％升至（16.22±2.33）％，(P＜0.05)。上述結果提示Id4基因可以通過激活P38MAPK信號通路導致肺腺癌細胞產生順鉑耐藥性，抑制P38MAPK信號通路可以部分逆轉Id4基因導致的肺腺癌順鉑耐藥。
　　6.探索上調Id4對肺鱗癌H520和肺大細胞癌H460順鉑

14、敏感性的影響。轉染Id4質粒使H460細胞的IC50由1.13±0.39μg/ml升至2.33±0.94μg/ml(P＜0.05)、凋亡率由14.21±2.07％下降到9.36±1.42％(P＜0.05)。但轉染Id4質粒對H520細胞順鉑半數(shù)抑制濃度IC50和細胞凋亡率均無影響(P＞0.05)。結果提示上調Id4基因可以使肺大細胞癌H460細胞對順鉑敏感性降低并產生耐藥。但Id4基因對肺鱗癌H520細胞的順鉑敏感性無影響。
　　

15、7.研究上調Id4導致H460細胞對順鉑產生耐藥機制，發(fā)現(xiàn)上調Id4使H460細胞中磷酸化的Stat3和p38MAPK蛋白表達量均升高。在上調Id4基因的H460細胞轉染SB202190(P38MAPK抑制劑)后，IC50由2.33±0.64μg/ml下降到1.86±0.23μg/ml、凋亡率由9.36±1.42％升至10.65±3.89％(P＜0.05)。同樣，在上調Id4基因的H460細胞轉染WP1066（Stat3抑制劑）后，IC

16、50由2.11±0.37μg/ml下降到1.59±0.21μg/ml，(P＜0.05)、細胞凋亡率從9.82±1.24％升至12.15±4.17％(P＜0.05)。研究結果提示Id4可能同時激活p38MAPK與Stat3信號通路來抑制順鉑誘導的凋亡過程，從而導致大細胞肺癌對順鉑耐藥。抑制P38MAPK和Stat3信號通路可以部分逆轉Id4基因導致的大細胞肺癌順鉑耐藥現(xiàn)象。
　　研究結論:
　　Id4造成肺腺癌順鉑耐藥的機制是