MicroRNA-136在非小細胞肺癌中的作用及其相關(guān)機制研究.pdf

1、MicroRNAs(miRNAs)通過抑制靶基因的翻譯在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮重要作用。研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有多種miRNAs與非小細胞肺癌(non-small-celllungcancer，NSCLS)的發(fā)生有密切關(guān)系，但是miR-136在NSCLC中的作用目前還不清楚。我們在本研究中發(fā)現(xiàn)，miR-136在NSCLC腫瘤組織中的表達顯著上調(diào)。通過對多種NSCLC細胞株進行檢測發(fā)現(xiàn)，與正常細胞株相比，NSCLC細胞株中miR-136的表達均有不

2、同程度的增加。抑制NSCLC細胞株A549中miR-136的表達能夠抑制該腫瘤細胞的錨定依賴性和非錨定依賴性增殖。同時，我們還發(fā)現(xiàn)miR-136促進NSCLC細胞的增殖與胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2（extracellular-signal-regulatedkinase1/2，Erk1/2）的活化有關(guān)。采用anti-miR-136抑制miR-136的表達后Erk1/2的磷酸化水平顯著降低。通過信息生物學方法結(jié)合熒光素酶報告基因分析的方法我們

3、發(fā)現(xiàn)，絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶2A55Kda調(diào)節(jié)亞基Bα(serine/threonineproteinphosphatase2A55kDaregulatorysubunitBαisoform，PPP2R2A，B55α)是miR-136的一個直接靶基因，抑制miR-136的表達能夠顯著上調(diào)PPP2R2AmRNA和PPP2R2A蛋白的表達水平。在NSCLC細胞中過表達PPP2R2A后miR-136引起的ERK1/2活化受到抑制，同時miR

4、-136引起的細胞增殖也受到抑制。對NSCLC組織進行免疫組化分析的結(jié)果也發(fā)現(xiàn)，PPP2R2A在NSCLC組織中的表達明顯低于正常的癌旁組織。說明，miR-136是通過抑制PPP2R2A的表達促進ERK1/2的磷酸化，總之，本研究發(fā)現(xiàn)在NSCLC中，miR-136通過抑制PPP2R2A促進ERK1/2的活化，從而促進細胞的增殖，提示其可能成為臨床NSCLC治療的一個有效靶點。
　　第一部分miR-136在NSCLC腫瘤組織及細胞株

5、中的表達
　　方法：
　　1.采用q-PCR的方法對37對NSCLC腫瘤組織，及其相應(yīng)的癌旁組織中miR-136的表達情況進行分析。并采用q-PCR方法對NSCLC細胞系A(chǔ)549，SPC-A1，NCI-H1299和正常支氣管上皮細胞系16HBE中miR-136的表達進行檢測
　　2.采用原位雜交的方法檢測了miR-136在NSCLC組織中的表達。
　　3.統(tǒng)計學處理:應(yīng)用SPSS13.0軟件處理數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)用均數(shù)±

6、標準差(x±s)，兩樣本均數(shù)比較采用獨立樣本t檢驗;兩個有序變量之間的相關(guān)性檢驗用Spearman相關(guān)分析，兩分類變量的比較用Pearson'sx2檢驗;以α=0.05為檢驗水準。P＜0.05時有統(tǒng)計學意義。
　　結(jié)果：
　　1.q-PCR和原位雜交的檢測結(jié)果均顯示，與相應(yīng)的正常組織相比，在NSCLC腫瘤組織中，miR-136的表達顯著增加。通過對患者臨床病理學特征進行分析發(fā)現(xiàn)，miR-136的表達與患者的性別和年齡沒有明顯

7、的關(guān)系，但是，在腺癌中的表達要高于鱗狀細胞癌。另外，miR-136的表達水平與腫瘤是否發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移沒有明顯的關(guān)系，但是和腫瘤的分化程度呈負相關(guān)。
　　2.q-PCR的檢測結(jié)果顯示，與正常支氣管上皮細胞株16HBE相比，NSCLC細胞株A549，SPC-A1，NCI-H1650和NCI-H1299中miR-136的表達均有不同程度的上調(diào)，其中在A549中的表達增加最為顯著。
　　第二部分miR-136上調(diào)激活Erk1/2促進

8、NSCLC細胞的增殖
　　方法：
　　1.采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法將miRNA抑制劑轉(zhuǎn)染至NSCLC細胞中，抑制miR-136的表達，并采用q-PCR的方法驗證抑制效果。
　　2.采用MTT分析和軟瓊脂克隆形成實驗檢測miR-136對NSCLC細胞的增殖能力的影響。
　　3.采用westernblot的方法檢測抑制NSCLC中的miR-136對Erk1/2信號通路的影響。
　　4.運用免疫組織化學的方法檢測NS

9、CLC組織中Erk1/2信號通路的活化情況。
　　5.統(tǒng)計學處理:應(yīng)用SPSS13.0軟件處理數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差(x±s)，采用one-wayANOVA與student'st檢驗各組間差異的顯著性，P＜0.05時有統(tǒng)計學意義。
　　結(jié)果：
　　1.與對照組相比，轉(zhuǎn)染了miR-136抑制劑anti-miR-136三天和五天之后，NSCLC細胞中miR-136的量分別下降了75％和64％(P＜0.05)。
　　

10、2.MTT分析實驗結(jié)果顯示:抑制NSCLC細胞A549中miR-136的表達量之后，細胞的增殖能力顯著下降，與對照組相比，轉(zhuǎn)染了anti-miR-136之后第5天細胞的存活率下降至71％(P＜0.05)。
　　3.軟瓊脂克隆形成實驗結(jié)果顯示:抑制A549細胞中miR-136的表達之后，細胞的克隆形成能力顯著下降。與對照組相比，轉(zhuǎn)染了anti-miR-136的細胞形成的克隆數(shù)減少了62％(P＜0.05)。
　　4.wester

11、nblot檢測結(jié)果顯示:抑制A549細胞中miR-136的表達使Erk1/2以劑量依賴的方式降低活性。轉(zhuǎn)染40nM的anti-miR-13672小時后，90％的Erk1/2磷酸化受到抑制。
　　5.免疫組織化學檢測結(jié)果顯示:在NSCLC組織中，Erk1/2的磷酸化上調(diào)與miR-136的表達上調(diào)相一致。與相應(yīng)的癌旁正常組織相比，NSCLC組織中Erk1/2的磷酸化水平明顯增高。
　　第三部分miR-136激活Erk1/2促進N

12、SCLC細胞增殖的機制研究
　　方法：
　　1.利用PicTar和TargetScan軟件進行分析預(yù)測miR-136的靶基因，并用熒光素酶報告基因分析的方法進行驗證。
　　2.采用轉(zhuǎn)染結(jié)合q-PCR或Westernblot的分別檢測miR-136對A549細胞中PPP2R2AmRNA和PPP2R2A蛋白表達的影響。
　　3.采用q-PCR和westemblot的方法檢測NSCLC組織中PPP2R2AmRNA和PP

13、P2R2A蛋白的表達情況。
　　4.結(jié)合臨床病理資料分析PPP2R2A表達與患者臨床病理特征是否有關(guān)聯(lián)。
　　5.通過在A549細胞中單獨過表達miR-136或者共同過表達PPP2R2A，結(jié)合westemblot檢測miR-136對Erk1/2的活化是否與PPP2R2A有關(guān)。
　　6.通過在A549細胞中單獨過表達miR-136或者共同過表達PPP2R2A，結(jié)合MTT實驗檢測PPP2R2A是否影響miR-136誘導(dǎo)的細

14、胞增殖。
　　7.統(tǒng)計學處理:應(yīng)用SPSS13.0軟件處理數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差(x±s)，采用one-wayANOVA與student'st檢驗各組間差異的顯著性，P＜0.05時有統(tǒng)計學意義。兩個有序變量之間的相關(guān)性檢驗用Spearman相關(guān)分析，兩分類變量的比較用Pearson'sx2檢驗;以α=0.05為檢驗水準。P＜0.05時有統(tǒng)計學意義。
　　結(jié)果：
　　1.PicTar和TargetScan軟件分析預(yù)測:

15、結(jié)果發(fā)現(xiàn)PPP2R2AmRNA3'UTR含有miR-136的可能結(jié)合位點，是miR-136的一個重要靶基因。
　　2.熒光素酶分析實驗:結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照miRNA相比，在A549中miR-136能夠顯著抑制含有野生型-3'UTR報告載體的熒光素酶活性，而對含有突變型-3'UTR的報告載體的熒光素酶活性沒有影響。
　　3.q-PCR和westemblot檢測:結(jié)果顯示，抑制miR-136的表達后A549細胞中PPP2R2AmR

16、NA和PPP2R2A蛋白的表達水平均明顯增加。
　　4.q-PCR和westemblot檢測:結(jié)果顯示，與正常組織相比，在NSCLC組織中PPP2R2AmRNA和PPP2R2A蛋白的表達降低，而且與miR-136的表達呈負相關(guān)。
　　5.病理學分析:結(jié)果提示miR-136表達與患者的年齡，性別及TNM級別沒有直接的關(guān)聯(lián)，但是，PPP2R2A與腫瘤的組織學分級有重要關(guān)系。
　　6.在A549細胞中過表達miR-136，P

17、PP2R2A的表達受到抑制，同時Erk1/2磷酸化水平上調(diào)。而共同過表達miR-136和PPP2R2A后，A549細胞中由miR-136誘導(dǎo)的Erk1/2磷酸化受到抑制。
　　7.在A549細胞中過表達miR-136，細胞增殖增加32％，而同時過表達miR-136和PPP2R2A后細胞增殖減少了44％。
　　結(jié)論：
　　1.miR-136在NSCLC組織及NSCLC細胞株中表達上調(diào)，提示miR-136的高表達與NSCL

18、C的發(fā)生有關(guān)。
　　2.抑制miR-136的表達能夠抑制NSCLC細胞的增殖，其作用機制可能與抑制Erk1/2的激活有關(guān)。
　　3.PPP2R2A是miR-136的靶基因，在NSCLC細胞株A549中抑制miR-136的表達，PPP2R2A的表達顯著增加。
　　4.過表達miR-136能夠促進A549細胞的增殖，而同時過表達PPP2R2A則使miR-136誘導(dǎo)的細胞增殖發(fā)生逆轉(zhuǎn)。
　　5.miR-136通過抑制P