CD47在非小細胞肺癌轉(zhuǎn)移中的作用及相關(guān)機制研究.pdf

1、背景和目的:肺癌在我國發(fā)病率極高，據(jù)報道近十幾年肺癌分別占在我國男性和女性惡性腫瘤發(fā)病率的第一和第二位，并且發(fā)病年齡也出現(xiàn)了下降的趨勢。其中非小細胞肺癌作為肺癌的一個大類發(fā)病率也逐年增高，近年來肺癌相關(guān)領(lǐng)域基礎(chǔ)醫(yī)學研究及臨床診斷治療方法逐漸進步，越來越多的肺癌患者得到了規(guī)范的治療，使得肺癌的診治率有了很大的提升，然而由于肺癌表現(xiàn)出較強的侵襲性，尤其是一旦肺癌發(fā)生轉(zhuǎn)移，患者即將面臨極高的死亡威脅。因此，總體來說，對肺癌的轉(zhuǎn)移情況進行控制仍

2、然是肺癌領(lǐng)域需要解決的重要關(guān)鍵問題。然而目前腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)分子機制仍不清楚。
　　為了探索腫瘤轉(zhuǎn)移的相關(guān)分子機制，近年來，CD47分子逐漸引起了大家的關(guān)注。其重要原因在于，研究發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞可以表達“別吃我”信號，從而使得巨噬細胞對腫瘤吞噬作用減低，出現(xiàn)腫瘤對免疫逃逸現(xiàn)象，這種現(xiàn)象與腫瘤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。而腫瘤細胞高表達的CD47分子就是一種“別吃我”信號分子。當腫瘤細胞表面CD47分子與巨噬細胞的表面SIRPα分子組合成CD47-SIR

3、Pα信號復(fù)合體時，導(dǎo)致巨噬細胞SIRPα分子的細胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)中免疫受體酪氨酸抑制基序(ITIM)發(fā)生磷酸化，因此可以傳導(dǎo)抑制性信號通路，即“別吃我”信號來減少巨噬細胞對腫瘤細胞的吞噬活性，這樣便產(chǎn)生腫瘤細胞的免疫逃逸現(xiàn)象。而且CD47高水平表達與血液系統(tǒng)惡性腫瘤和部分實體腫瘤的分化程度、轉(zhuǎn)移能力、生存率及預(yù)后密切相關(guān)。CD47與腫瘤相關(guān)性研究得到越來越多關(guān)注，然而CD47在肺癌表達及與轉(zhuǎn)移的相關(guān)性等研究未見相關(guān)報道。另一方面，除了研究者關(guān)

4、注的CD47-SIRPα信號復(fù)合體引起的腫瘤免疫逃逸現(xiàn)象，另有研究者提出CD47與腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的作用仍有其他機制參與其中，然而相關(guān)的機制研究甚少。因此，本研究亦將對CD47與轉(zhuǎn)移的相關(guān)作用機制進行初步的探討。我們通過組織標本和肺癌細胞株的CD47表達情況進行分別檢測，并利用體內(nèi)和體外實驗分別對CD47與肺癌轉(zhuǎn)移的相關(guān)性進行分析驗證。最后對CD47與肺癌轉(zhuǎn)移的相關(guān)機制進行初步探討。本研究分以下三部分進行。
　　研究方法:1.非小細

5、胞肺癌組織CD47的表達及其臨床意義
　　選取20例非小細胞肺癌者切除的手術(shù)標本，利用western blotting方法對癌及癌旁組織中的CD47表達水平進行檢測。同時采用免疫組織化學檢測方法對80例非小細胞肺癌患者的石蠟組織切片對CD47表達水平進行檢測，通過免疫組織化學評分將80例患者按照CD47表達水平分為低表達CD47組和高表達CD47組，利用統(tǒng)計學分析的方法對不同CD47表達水平與病理分型、腫瘤分化程度及TNM分期等臨

6、床病理特征進行分析。
　　2.CD47在NSCLC侵襲轉(zhuǎn)移中的作用
　　本部分研究分別從體外實驗和體內(nèi)實驗兩方面進行闡述。體外實驗部分:首先利用western blot、real-time PCR和細胞免疫熒光對不同肺癌細胞株的CD47表達情況進行檢測。為驗證CD47表達水平與細胞轉(zhuǎn)移能力的關(guān)系，我們構(gòu)建了基于微流控芯片技術(shù)的轉(zhuǎn)移模型。利用該模型我們可以對細胞在不同情況下的轉(zhuǎn)移情況進行實時的動態(tài)觀察。利用RNA干擾技術(shù)和質(zhì)粒

7、轉(zhuǎn)染技術(shù)分別下調(diào)或上調(diào)肺腺癌細胞株A549和肺鱗癌細胞株NCI-H520的CD47表達，將進行不同處理的各組細胞株分別注入微流控芯片轉(zhuǎn)移模型內(nèi)觀察72小時后細胞的轉(zhuǎn)移情況，分析不同CD47表達水平表現(xiàn)出的肺癌細胞體外轉(zhuǎn)移能力的差異和區(qū)別。體內(nèi)實驗部分:通過皮下注射構(gòu)建原位肺癌模型、通過尾靜脈注射構(gòu)建肺癌移植模型，同時利用shRNA穩(wěn)定下調(diào)A549細胞的CD47表達，觀察在兩種動物模型中不同CD47表達的A549細胞的原位成瘤以及腫瘤轉(zhuǎn)移

8、情況，進一步驗證CD47與肺癌發(fā)展轉(zhuǎn)移的影響。
　　3.CD47促進非小細胞肺癌轉(zhuǎn)移機制的初步探討
　　為探討Cdc42作為CD47的下游分子參與非小細胞肺癌侵襲和轉(zhuǎn)移我們進行以下研究，利用western blot方法檢測不同肺癌細胞株CD47和Cdc42的表達情況;通過RNA干擾技術(shù)和質(zhì)粒轉(zhuǎn)染技術(shù)分別下調(diào)或上調(diào)肺腺癌細胞株A549和肺鱗癌細胞株NCI-H520的CD47表達，進一步觀察CD47表達水平變化是否伴隨Cdc42

9、表達改變。上調(diào)CD47表達的A549和NCI-H520細胞株再利用RNA干擾技術(shù)下調(diào)Cdc42表達后觀察不同處理情況的細胞株在微流控芯片轉(zhuǎn)移平臺內(nèi)細胞轉(zhuǎn)移能力的情況。最后對80例非小細胞肺癌患者的石蠟切片CD47表達與Cdc42表達情況進行統(tǒng)計分析。
　　結(jié)果:1.非小細胞肺癌組織CD47的表達及其臨床意義
　　利用western blotting蛋白檢測方法對20例非小細胞肺癌患者的手術(shù)切除組織標本的癌及癌旁組織中CD47

10、表達水平進行檢測，發(fā)現(xiàn)癌組織的CD47表達水平明顯高于癌旁組織(P＜0.05)。同時采用免疫組織化學檢測方法對80例非小細胞肺癌患者的石蠟切片對CD47表達水平進行檢測，結(jié)果亦證實癌組織CD47表達明顯高于癌旁組織，對不同患者的CD47表達水平進行分組，結(jié)果發(fā)現(xiàn)高表達CD47與TNM分期密切相關(guān)，高表達CD47的患者更易出現(xiàn)淋巴轉(zhuǎn)移和遠處轉(zhuǎn)移;另外高表達CD47與臨床分期亦相關(guān)，高表達CD47的患者臨床分期越差。提過提示CD47表達水平

11、與非小細胞肺癌的轉(zhuǎn)移和侵襲相關(guān)，對CD47的表達檢測將對臨床轉(zhuǎn)移和預(yù)后的判斷具有重要意義。
　　2.CD47在NSCLC侵襲轉(zhuǎn)移中的作用
　　為了在體外觀察驗證細胞的轉(zhuǎn)移能力，我們成功構(gòu)建了基于微流控芯片技術(shù)的細胞轉(zhuǎn)移模型。利用該模型我們可以實時對不同細胞的轉(zhuǎn)移情況進行動態(tài)觀察。為了更加全面驗證的CD47在NSCLC侵襲轉(zhuǎn)移中的作用，我們分別選取了肺腺癌細胞株A549和肺鱗癌細胞株NCI-H520分別進行檢測分析。利用RNA

12、干擾技術(shù)成功將A549和NCI-H520的CD47表達水平下調(diào)，進而將未處理和下調(diào)CD47表達的A549和NCI-H520細胞分別注入微流控芯片轉(zhuǎn)移模型內(nèi)，觀察72小時后細胞的轉(zhuǎn)移情況，結(jié)果證實在下調(diào)CD47表達的A549和NCI-H520細胞轉(zhuǎn)移數(shù)量較對照組明顯減少，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。為進一步驗證，我們利用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染A549和NCI-H520細胞穩(wěn)定上調(diào)CD47表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在上調(diào)CD47表達后A549和NCI-H52

13、0的細胞轉(zhuǎn)移數(shù)量明顯增高，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。體內(nèi)實驗進一步觀察，穩(wěn)定下調(diào)CD47表達的A549組6只裸鼠的皮下成瘤體積大小較A549組明顯減小;在尾靜脈注射轉(zhuǎn)移模型小鼠中同樣觀察到穩(wěn)定下調(diào)CD47表達的A549組形成的肝轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)量少于A549組。
　　3.CD47促進非小細胞肺癌轉(zhuǎn)移機制的初步探討
　　通過western blot檢測了不同肺癌細胞株CD47蛋白表達與Cdc42蛋白表達情況，發(fā)現(xiàn)在高表達C

14、D47的細胞株中Cdc42也呈高表達，反之亦然。為驗證Cdc42作為CD47的下游分子參與了肺癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，我們對A549和NCI-H520分別下調(diào)或上調(diào)CD47表達，利用western blot檢測了Cdc42的蛋白表達情況，結(jié)果表明CD47表達水平的變化伴隨了Cdc42表達水平的改變。對80例肺癌患者對組織切片進行免疫組織化學染色觀察，發(fā)現(xiàn)在高表達CD47的患者中80.4％也存在Cdc42高表達;在低表達CD47的患者中85.

15、3％也存在Cdc42低表達。表明CD47表達調(diào)節(jié)了Cdc42的表達情況。為進一步驗證CD47通過Cdc42調(diào)節(jié)細胞的轉(zhuǎn)移和侵襲，我們利用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染A549和NCI-H520上調(diào)CD47的表達，再利用RNA干擾技術(shù)下調(diào)Cdc42表達，在微流控芯片轉(zhuǎn)移平臺內(nèi)觀察下調(diào)Cdc42表達后細胞的侵襲轉(zhuǎn)移數(shù)量較未下調(diào)Cdc42表達的對照組明顯減少，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　結(jié)論:1.通過western blot和免疫組織化學染色檢測

16、到非小細胞肺癌組織標本的CD47表達癌組織明顯高于癌旁組織;CD47表達與患者轉(zhuǎn)移情況、臨床分期相關(guān)，高表達CD47的患者臨床分期越差、更易出現(xiàn)淋巴轉(zhuǎn)移和遠處轉(zhuǎn)移。因此提示CD47分子可以在非小細胞肺癌中判斷侵襲和轉(zhuǎn)移的一個指標。
　　2.成功構(gòu)建了可以模擬細胞侵襲轉(zhuǎn)移過程的微流控芯片轉(zhuǎn)移模型。在該芯片模型內(nèi)可以實現(xiàn)細胞的三維培養(yǎng)并對細胞的侵襲轉(zhuǎn)移數(shù)量進行實時的動態(tài)觀察，通過比較轉(zhuǎn)移細胞數(shù)量的差別來直觀驗證細胞的轉(zhuǎn)移能力。采用肺腺

17、癌細胞株A549和肺鱗癌細胞株NCI-H520作為研究對象，利用RNA干擾技術(shù)和質(zhì)粒表達下調(diào)和上調(diào)兩種細胞株的CD47表達，觀察兩種細胞株在微流控芯片轉(zhuǎn)移模型內(nèi)處理前后細胞轉(zhuǎn)移數(shù)量的差異，證實CD47表達與細胞的轉(zhuǎn)移侵襲能力中發(fā)揮重要作用。進一步在體內(nèi)成瘤以及轉(zhuǎn)移模型中亦證實下調(diào)CD47表達，A549細胞體內(nèi)成瘤和轉(zhuǎn)移能力均降低。說明CD47分子在判定非小細胞肺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移現(xiàn)象中起到重要的作用。
　　3.CD47在肺癌細胞株中表