腦出血后CD47表達(dá)及其作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、自發(fā)性腦出血(Spontaneous intracerebral hemorrhage，ICH)是一種常見(jiàn)的中風(fēng)亞型，發(fā)病后情況往往很嚴(yán)重，其死亡率高達(dá)40％以上，而且生還者往往有明顯的神經(jīng)功能損傷。腦出血的發(fā)病人數(shù)呈逐年上升的趨勢(shì)。但是來(lái)源于全球多個(gè)中心的關(guān)于腦出血療效的Meta分析文獻(xiàn)表明，腦出血后，缺乏有效的治療方法。
　　CD47也被稱為整合素相關(guān)蛋白，是免疫球蛋白(Ig)超家族中的重要成員。近來(lái)研究發(fā)現(xiàn)CD47在中樞神經(jīng)

2、系統(tǒng)中有重要的作用。有體外研究表明，通過(guò)病毒轉(zhuǎn)染使神經(jīng)元CD47過(guò)度表達(dá)會(huì)引起神經(jīng)元細(xì)胞凋亡，血小板反應(yīng)蛋白(TSPs)結(jié)合激活CD47有神經(jīng)毒性，會(huì)觸發(fā)神經(jīng)元死亡。1，2同時(shí)，近來(lái)有研究表明，紅細(xì)胞上的CD47通過(guò)與巨噬細(xì)胞表面的抑制性受體信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白α(SIRPα)相互作用抑制吞噬。紅細(xì)胞上CD47的表達(dá)降低能促進(jìn)巨噬細(xì)胞對(duì)紅細(xì)胞的的吞噬清除。
　　基于這些研究背景，我們提出了如下問(wèn)題和設(shè)想:CD47在腦出血后表達(dá)情況是怎樣的

3、？能否通過(guò)調(diào)節(jié)CD47減輕神經(jīng)元的損傷，減輕腦出血后的神經(jīng)功能障礙？能否通過(guò)調(diào)節(jié)紅細(xì)胞表面的CD47的表達(dá)，來(lái)加速小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞對(duì)紅細(xì)胞的吞噬，加速血腫的清除？
　　為了解決這些問(wèn)題，我們進(jìn)行了如下的實(shí)驗(yàn)研究:1.研究了豬腦出血模型中CD47的表達(dá)情況，以及去鐵敏治療對(duì)CD47表達(dá)的影響。2.體外實(shí)驗(yàn)中觀察小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞對(duì)紅細(xì)胞的吞噬現(xiàn)象，并研究了紅細(xì)胞表面CD47表達(dá)變化對(duì)吞噬的影響作用。3.利用CD47基因敲除小鼠

4、與野生型小鼠的腦出血?jiǎng)游锬Ｐ?，研究CD47在腦出血后的作用，包括血腫清除的速度、神經(jīng)細(xì)胞死亡、以及神經(jīng)功能障礙與恢復(fù)等。
　　第一部分 豬腦出血后CD47表達(dá)及相關(guān)研究
　　目的:研究豬腦出血后CD47的表達(dá)情況，去鐵敏治療對(duì)腦出血后CD47表達(dá)的影響。
　　方法:采用立體定向腦內(nèi)注射自體動(dòng)脈血的方法制作豬的腦出血模型。豬接收安慰劑或去鐵敏治療(50 mg/kg肌注，從腦出血后2小時(shí)開(kāi)始，每12小時(shí)1次，持續(xù)3天或7天

5、)。于腦出血模型制作后4小時(shí)，1天，3天，7天或者14天處死豬。行CD47免疫組化染色，免疫熒光染色，以及Western-Blot分析。
　　結(jié)果:腦出血后同側(cè)白質(zhì)和灰質(zhì)中CD47的表達(dá)水平，從腦出血后4小時(shí)開(kāi)始升高，腦出血后3天達(dá)到高峰。在同側(cè)白質(zhì)和灰質(zhì)中，CD47表達(dá)都明顯升高;而對(duì)側(cè)白質(zhì)和灰質(zhì)中，CD47表達(dá)無(wú)明顯改變。CD47表達(dá)于神經(jīng)元、小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞，但不表達(dá)于星形膠質(zhì)細(xì)胞。去鐵敏治療可以減輕腦出血

6、后CD47表達(dá)水平的升高。血腫內(nèi)紅細(xì)胞上CD47表達(dá)隨時(shí)間推移逐漸降低。
　　第二部分 CD47與紅細(xì)胞吞噬關(guān)系的體外研究
　　目的:研究體外培養(yǎng)的小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞對(duì)紅細(xì)胞的吞噬現(xiàn)象。研究紅細(xì)胞表面CD47表達(dá)變化對(duì)紅細(xì)胞吞噬的影響。
　　方法:進(jìn)行大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞的培養(yǎng)，用PKH26標(biāo)記紅細(xì)胞(年輕紅細(xì)胞組與衰老紅細(xì)胞組），將標(biāo)記好的紅細(xì)胞加入培養(yǎng)的小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞中。用免疫熒光染色，觀察吞噬現(xiàn)象;用

7、流式細(xì)胞儀對(duì)吞噬進(jìn)行定量研究。
　　結(jié)果:可以在體外觀察到小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞對(duì)紅細(xì)胞的吞噬現(xiàn)象;衰老紅細(xì)胞CD47表達(dá)降低，小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞對(duì)衰老紅細(xì)胞的吞噬增加。
　　第三部分 CD47基因敲除小鼠與野生型小鼠的腦出血模型
　　目的:比較研究CD47基因敲除小鼠與野生型小鼠在腦出血后，血腫清除速度、神經(jīng)功能缺損、神經(jīng)細(xì)胞損傷的不同。
　　方法:分別制作自體血注射的CD47基因敲除小鼠與野生型小鼠的腦出血模

8、型。在腦出血后第1天和第8天，行磁共振檢查;在腦出血后第1天，第3天和第8天進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)價(jià);在腦出血后8天處死小鼠，用Fluoro-Jade C染色法檢測(cè)神經(jīng)細(xì)胞變性壞死。
　　結(jié)果:CD47基因敲除小鼠的血腫清除速度比野生型小鼠要快。腦出血同側(cè)腦內(nèi)Fluoro-Jade C染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)野生型小鼠比CD47基因敲除小鼠多。CD47基因敲除小鼠有較好的神經(jīng)功能恢復(fù)和預(yù)后。
　　全文結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)用豬腦出血模型，體外實(shí)驗(yàn)，以及

9、通過(guò)CD47基因敲除小鼠與野生型小鼠腦出血后的比較，研究腦出血后CD47的表達(dá)及其作用，結(jié)果表明:
　　1.腦出血后腦組織中CD47表達(dá)升高，而去鐵敏可以減輕CD47的升高，說(shuō)明CD47是反應(yīng)腦損傷的一個(gè)指標(biāo)。
　　2.與野生型小鼠相比，CD47基因敲除小鼠腦出血后神經(jīng)變性壞死減少，有較好預(yù)后，說(shuō)明CD47也是腦出血后腦損傷的一個(gè)環(huán)節(jié)，可以通過(guò)這一環(huán)節(jié)改善腦出血預(yù)后。
　　3.紅細(xì)胞上CD47表達(dá)降低促進(jìn)紅細(xì)胞吞噬，C