CD47分子胞外段蛋白的表達及其對Jurkat細胞的作用研究.pdf

1、惡性腫瘤發(fā)生過程中會產(chǎn)生一系列的細胞學和遺傳學突變，導致癌基因的激活，抑癌基因的失活。大部分的惡性腫瘤細胞都擁有一些共同的特征，包括很強的增殖活性，組織侵襲性和轉(zhuǎn)移，細胞生長信號通路的失調(diào)，持續(xù)的血管發(fā)生，抑制各種細胞死亡通路等等。近來研究表明，腫瘤細胞能夠通過一些特殊的機制逃避免疫系統(tǒng)的清除作用。CD47作為抗吞噬作用的信號分子，在腫瘤的免疫監(jiān)視中發(fā)揮著重要作用，腫瘤細胞可以通過上調(diào)CD47的表達抑制吞噬作用。在對于白血病的研究中發(fā)現(xiàn)

2、，許多類型白血病細胞及白血病干細胞的CD47表達都高于正常水平。CD47與巨噬細胞上受體信號調(diào)節(jié)蛋白α(SIRPα)的相互作用傳遞抑制信號，阻止腫瘤細胞被吞噬細胞清除。而采用抗CD47單克隆抗體阻斷這一信號通路后，能夠促進巨噬細胞對腫瘤細胞的清除作用，具有治療意義。目前已在急性髄系白血病，非霍奇金淋巴瘤，急性淋巴細胞白血病中得到了驗證，而CD47-SIRPα信號通路作用的深入分子機制還有待進一步研究。
　　腫瘤細胞上的高表達的CD

3、47需要與巨噬細胞上受體SIRPα相結(jié)合才能發(fā)揮作用，我們通過原核表達系統(tǒng)獲得包含結(jié)合位點的可溶性CD47胞外段蛋白，發(fā)揮“占位”作用，與腫瘤細胞表面的CD47競爭結(jié)合SIRPα，從而阻斷CD47-SIRPα信號通路，促進巨噬細胞對腫瘤細胞的清除作用。與CD47單克隆抗體有異曲同工之處。我們希望通過這一方法進一步研究CD47在白血病治療中作用的深入分子機制，對于白血病及其他惡性腫瘤的靶向治療具有重要意義。
　　為此我們進行了如下工

4、作：
　　1.原核表達可溶性CD47胞外段蛋白。用PCR技術(shù)以人淋巴結(jié)cDNA為模板擴增出人CD47分子的胞外段，測序正確后將其插入原核表達載體pET32a(+)中，獲得表達載體pET32a-hCD47ext。之后將表達載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，用IPTG誘導蛋白表達，優(yōu)化表達條件，使目的蛋白獲得最佳表達，擴大表達后用針對His標簽的鎳金屬螯合柱純化，蛋白裂解后獲得純的TrxHis-hCD47ext蛋白。用SDS-PAGE及Wes

5、ternblot分析蛋白的表達情況及蛋白大小的正確性。
　　2.可溶性CD47胞外段蛋白TrxHis-hCD47ext與其受體SIRPα的結(jié)合。將我們表達的CD47胞外段蛋白添加到培養(yǎng)的巨噬細胞的上清中，用抗His的抗體通過流式細胞儀間接檢測結(jié)合后細胞表面熒光強度的變化，從而驗證TrxHis-hCD47ext是否能夠與SIRPα相結(jié)合。
　　3.TrxHis-hCD47ext對人急性T淋巴細胞白血病細胞系Jurkat的作用。

6、為了驗證可溶性的CD47胞外段蛋白是否能夠阻斷CD47-SIRPα信號通路，從而促進巨噬細胞對白血病細胞的清除作用，我們采用Dio標記的Jurkat細胞與巨噬細胞共培養(yǎng)的方法，將TrxHis-hCD47ext添加到共培養(yǎng)的上清中，用熒光顯微鏡觀察蛋白作用后巨噬細胞對白血病細胞的吞噬作用的變化，同時驗證TrxHis-hCD47ext的活性及功能。
　　結(jié)論：
　　1.實現(xiàn)了人CD47胞外段蛋白在原核表達系統(tǒng)中的可溶性表達，獲得