骨膜蛋白在非小細胞肺癌中的作用及相關(guān)機制的研究.pdf

1、背景：骨膜蛋白(periostin, POSTN)也被稱為成骨細胞特異性因子-2（osteoblast-specific factor2, OSF-2），是由成骨細胞分泌的一種多功能胞外基質(zhì)蛋白。據(jù)文獻報道其在胰腺癌、卵巢癌和前列腺癌等多種不同類型的腫瘤中高表達，并由此成為惡性腫瘤轉(zhuǎn)移的候選基因之一。研究顯示骨膜蛋白的高表達與非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer NSCLC）的不良預(yù)后密切相關(guān)。此外骨膜蛋白

2、還可影響腫瘤細胞對化療的敏感性，卵巢癌及直腸癌基礎(chǔ)研究中表明骨膜蛋白可激活某些信號通路而導(dǎo)致化療耐藥。而骨膜蛋白與非小細胞肺癌順鉑（Cisplatin, CDDP）耐藥之間的關(guān)系及其可能的機制，至今尚未有學(xué)者探討和研究。
　　基于此，本課題系統(tǒng)探討了骨膜蛋白在非小細胞肺癌順鉑耐藥中的作用及其相關(guān)的作用機制。第一部分，我們通過梯度增加順鉑給藥劑量，構(gòu)建了人非小細胞肺癌順鉑耐藥細胞株A549/CDDP；并分析耐藥細胞株A549/CDD

3、P與親本細胞株A549中骨膜蛋白的表達情況。初步探討了骨膜蛋白的表達與人非小細胞肺癌順鉑耐藥之間的相關(guān)性。第二部分，通過構(gòu)建骨膜蛋白過表達載體，在體外研究了過表達骨膜蛋白對順鉑誘導(dǎo)的A549細胞部分生物學(xué)行為，如細胞的增殖及細胞周期、細胞凋亡等的影響；同時研究了抑制凋亡的重要信號通路Stat3/survivin在其中發(fā)揮的作用，進一步探討其可能涉及的作用機制。第三部分，首先在耐藥細胞株A549/CDDP上，通過沉默骨膜蛋白的表達觀察細胞

4、相關(guān)生物學(xué)行為的改變，探討沉默骨膜蛋白是否可以在體外逆轉(zhuǎn)非小細胞肺癌順鉑耐藥的發(fā)生及相關(guān)作用機制；然后通過建立裸鼠非小細胞肺癌異體移植瘤模型，在體內(nèi)進一步探討沉默骨膜蛋白的表達對非小細胞肺癌順鉑耐藥的影響。
　　第一部分：骨膜蛋白與非小細胞肺癌順鉑耐藥的相關(guān)性分析
　　目的：本研究的目的是通過梯度增加順鉑給藥劑量，構(gòu)建人非小細胞肺癌順鉑耐藥細胞株A549/CDDP；并分析耐藥細胞株A549/CDDP與親本細胞株A549中骨膜

5、蛋白的表達情況。初步探討骨膜蛋白的表達與人非小細胞肺癌順鉑耐藥之間的相關(guān)性。
　　方法：對體外培養(yǎng)的A549細胞給予不同濃度的順鉑刺激，并通過MTT法計算其半數(shù)抑制率(IC50)，然后采用梯度增加順鉑劑量的方法構(gòu)建A549的順鉑耐藥細胞株A549/CDDP。檢測不同濃度順鉑作用下A549細胞中骨膜蛋白的mRNA及蛋白表達情況；并比較兩株細胞中骨膜蛋白的mRNA及蛋白表達情況，研究骨膜蛋白與非小細胞肺癌順鉑耐藥的相關(guān)性。統(tǒng)計方法采用

6、單因素方差分析檢驗。
　　結(jié)果：
　　1、采用梯度增加順鉑劑量的方法，最終獲得在20μM的含順鉑培養(yǎng)基中穩(wěn)定增長并持續(xù)增殖的細胞株，即為順鉑耐藥細胞株A549/CDDP。A549/CDDP及 A549的半數(shù)抑制濃度(IC50)分別為25μM和10μM， A549/CDDP對順鉑的耐藥性明顯增加。
　　2、采用0~30μmol·L-1CDDP處理細胞48h后，檢測骨膜蛋白的表達水平。結(jié)果顯示，隨著CDDP濃度的增加，骨膜

7、蛋白的mRNA和蛋白表達水平均呈現(xiàn)增多的趨勢。骨膜蛋白的表達水平與CDDP的濃度呈正相關(guān)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，P?0.01。
　　3、耐藥細胞株A549/CDDP中骨膜蛋白的mRNA表達水平是親本細胞株A549的6倍（P?0.05）；且A549/CDDP中骨膜蛋白的蛋白表達水平是A549的5.1倍（P?0.05），差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)論：
　　1、針對人非小細胞肺癌細胞株A549，通過梯度增加順鉑給藥劑量，成功

8、構(gòu)建了順鉑耐藥細胞株A549/CDDP。
　　2、通過對A549和A549/CDDP兩株細胞耐藥性和骨膜蛋白表達的分析，發(fā)現(xiàn)骨膜蛋白的表達與非小細胞肺癌順鉑耐藥之間呈正相關(guān)。
　　第二部分：骨膜蛋白對A549細胞部分生物學(xué)行為的影響及相關(guān)機制
　　目的：分析骨膜蛋白對人非小細胞肺癌細胞株A549的增殖、細胞周期、細胞凋亡等一系列生物學(xué)行為的影響；并研究抑制凋亡的重要信號通路Stat3/survivin在其中發(fā)揮的作用，

9、進一步探討其可能涉及的作用機制。
　　方法：
　　1、構(gòu)建骨膜蛋白過表達質(zhì)粒載體，將過表達載體通過瞬時轉(zhuǎn)染的方式轉(zhuǎn)入A549細胞中，檢測其轉(zhuǎn)染效率。
　　2、采用MTT、流式細胞術(shù)、Western blot方法檢測骨膜蛋白過表達對順鉑誘導(dǎo)的A549細胞生存率、細胞周期、細胞凋亡的影響，檢測Stat3/survivin信號通路的活性。
　　3采用質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染的方法同時在A549細胞中過表達骨膜蛋白和沉默survivi

10、n，研究骨膜蛋白調(diào)控順鉑耐藥的可能作用機制。
　　結(jié)果：
　　1、將構(gòu)建的骨膜蛋白質(zhì)粒轉(zhuǎn)入A549細胞之后，可顯著提高骨膜蛋白的表達。
　　2、MTT結(jié)果提示，同對照組相比，10~30μM CDDP刺激下骨膜蛋白過表達組細胞活力分別增加1.56±0.37、1.62±0.17、3.43±1.82倍(P<0.05)；說明外源性過表達骨膜蛋白可顯著增加A549細胞對順鉑的抵抗力。
　　3、流式細胞術(shù)DNA含量檢測細胞的

11、周期分布。結(jié)果顯示：對照組、10μMCDDP處理組、CDDP+pcDNA3.1(+)vector處理組G0/G1期細胞數(shù)所占百分比分別為：50.04±3.27％，90.30±4.25%，88.2±3.78%，S期細胞所占百分比分別為：46.44±2.31%，8.69±2.79%，8.92±2.81%，轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)vector對CDDP抑制的周期轉(zhuǎn)換未見明顯影響(P>0.05)；相對于CDDP處理組，CDDP+POSTN過表

12、達組G0/G1期細胞所占百分比由90.3±4.25%降低到67.49±5.3%，與之對應(yīng)的S期細胞比例則由8.69±2.79%增加到28.84±2.11%（P<0.05 vs CDDP)。
　　4、流式細胞儀AnnexinV/PI雙染法定量分析A549細胞凋亡情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：對照組、10μM CDDP處理組、CDDP+pcDNA3.1(+) vector處理組細胞早期凋亡率分別為：2.45±0.56%，26.32±2.21%，27

13、.93±3.71%，細胞中晚期凋亡/壞死率分別為：2.57±0.46%，13.02±2.01%，12.33±2.35%；相對于CDDP處理組，CDDP+POSTN過表達組細胞早期凋亡率由26.32±2.21%降低到11.91±2.74%，細胞中晚期凋亡/壞死率則由13.02±2.01%降低到7.03±2.05%(P<0.05vsCDDP)，外源性過表達骨膜蛋白可顯著抑制CDDP誘導(dǎo)的A549細胞凋亡。
　　5、 Western B

14、lot檢測A549細胞Caspase-3的活化情況，結(jié)果顯示，10μM CDDP刺激細胞后，A549細胞激活型Caspase-3的表達量明顯增加，但是過表達POSTN轉(zhuǎn)染組則可明顯逆轉(zhuǎn)CDDP對Caspase-3的活化。
　　6、 A549細胞株過表達骨膜蛋白后，檢測Stat3/survivin信號通路活性的變化，結(jié)果顯示：同對照組相比，10μMCDDP處理48h可使A549細胞中Stat3的磷酸化水平降低到0.43±0.05倍，

15、過表達骨膜蛋白之后，CDDP誘導(dǎo)的Stat3的磷酸化水平從0.43±0.05增加到0.87±0.09(P<0.05vs.CDDP)；10μM CDDP處理48h后，細胞中survivin的表達減少到0.38±0.03倍，過表達骨膜蛋白后， CDDP誘導(dǎo)的survivin的表達水平從0.38±0.03增加到0.79±0.06(P<0.05vs CDDP)。
　　7、在過表達骨膜蛋白的A549細胞中沉默survivin之后，流式細胞術(shù)

16、分析結(jié)果顯示：10μMCDDP處理組，骨膜蛋白過表達組細胞早期凋亡率分別為：26.89±2.24%，13.13±1.54%，細胞中晚期凋亡/壞死率分別為：13.24±2.63%，8.42±2.57%；相對于POSTN過表達組，POSTN+S-shRNA組細胞早期凋亡率由13.13±1.54%增加到19.97±2.14%(P<0.05 vs POSTN)。除此之外，過表達POSTN可明顯抑制A549細胞上CDDP誘導(dǎo)的Caspase-3的

17、活化，但干擾survivin的表達之后，這一抑制作用被逆轉(zhuǎn)(P<0.05 vs CDDP)。
　　結(jié)論：成功構(gòu)建了骨膜蛋白過表達載體，研究表明在A549細胞中外源性過表達骨膜蛋白可通過促進細胞周期轉(zhuǎn)換，促進細胞增殖，同時抑制細胞凋亡，逆轉(zhuǎn)順鉑的促凋亡作用。其作用機制可能是骨膜蛋白激活Stat3/survivin信號通路，進而導(dǎo)致腫瘤細胞產(chǎn)生凋亡抵抗。
　　第三部分：沉默骨膜蛋白逆轉(zhuǎn)非小細胞肺癌順鉑耐藥的體內(nèi)外研究
　　

18、目的：利用骨膜蛋白干擾shRNA構(gòu)建骨膜蛋白低表達的耐藥細胞A549/CDDP，探討沉默骨膜蛋白是否可以在體外逆轉(zhuǎn)非小細胞肺癌耐藥的發(fā)生及相關(guān)作用機制；通過建立裸鼠非小細胞肺癌異體移植瘤模型，在體內(nèi)進一步探討沉默骨膜蛋白的表達對非小細胞肺癌順鉑耐藥的影響。
　　方法：
　　1、利用骨膜蛋白干擾shRNA沉默耐藥細胞A549/CDDP中骨膜蛋白的表達，通過MTT、流式細胞術(shù)、western blot檢測技術(shù)觀察細胞生存率及細胞

19、凋亡等相關(guān)生物學(xué)行為的改變。
　　2、建立裸鼠非小細胞肺癌異體移植瘤模型，觀察沉默骨膜蛋白的表達對順鉑抑瘤效率的影響，比較分析腫瘤組織中Stat3/survivin信號通路活性的變化。
　　結(jié)果：
　　1、采用western blot的方法檢測經(jīng)G418篩選后穩(wěn)定轉(zhuǎn)染P-shRNA的A549/CDDP中骨膜蛋白的干擾效率。結(jié)果顯示：P-shRNA組骨膜蛋白的表達是對照組的0.42±0.09倍，且位置正確。說明轉(zhuǎn)染P-s

20、hRNA可顯著降低內(nèi)源性骨膜蛋白的表達。
　　2、 MTT結(jié)果顯示：同對照組相比，0~30μMCDDP刺激下P-shRNA組細胞活力分別為1.0±0.05、0.7±0.04、0.64±0.09倍(P<0.05)，說明外源性沉默骨膜蛋白可提高耐藥細胞株A549/CDDP對順鉑的敏感性。
　　3、流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：對照組（A549/CDDP），30μM CDDP處理組，CDDP+C-shRNA處理組細胞早期凋

21、亡率分別為：2.15±0.41%，13.41±2.43%，15.14±2.54%，細胞中晚期凋亡/壞死率分別為：1.92±0.32%，8.83±2.01%，10.01±2.37%；相對于CDDP處理組， CDDP+P-shRNA組細胞早期凋亡率由13.41±2.43%增加到29.87±3.21%，細胞中晚期凋亡/壞死率則由8.83±2.01%增加到20.13±3.14%(P<0.05 vs CDDP)。
　　4、通過對移植瘤體積的

22、測量發(fā)現(xiàn)，用藥前各組裸鼠移植瘤平均體積未見統(tǒng)計學(xué)差異（P>0.05）；給予PBS或CDDP干預(yù)20天后，C-shRNA+PBS組、P-shRNA+PBS組、C-shRNA+CDDP組、P-shRNA+CDDP組移植瘤體積分別為(2900±150.28)、(2100±135.16)、(1630.75±109.60)、(445±41.04)mm3，均大于各組給藥前體積（P<0.01），P-shRNA+CDDP組移植瘤體積最小。
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23、、對移植瘤組織中Stat3/survivin信號通路活性的檢測發(fā)現(xiàn)：同C-shRNA+PBS組相比，C-shRNA+CDDP治療組移植瘤組織中Stat3的磷酸化水平降低到0.63±0.06倍，沉默骨膜蛋白后，P-shRNA+CDDP治療組移植瘤組織中Stat3的磷酸化水平則進一步降低至0.32±0.03(P<0.05vs C-shRNA)；同C-shRNA+PBS組相比，C-shRNA+CDDP治療組移植瘤組織中survivin的表達水

24、平降低到0.58±0.07倍，沉默骨膜蛋白后， P-shRNA+CDDP治療組移植瘤組織中survivin的表達水平則進一步降低至0.21±0.02(P<0.05vs C-shRNA)。
　　結(jié)論：
　　1、沉默骨膜蛋白可顯著增加人非小細胞肺癌順鉑耐藥細胞A549/CDDP對順鉑的敏感性，促進細胞凋亡。
　　2、體內(nèi)研究同樣顯示沉默骨膜蛋白可提高順鉑的抑瘤效率，并抑制Stat3的磷酸化及其下游靶基因Survivin蛋白