腫瘤相關(guān)性巨噬細(xì)胞在胃癌進展中的作用及相關(guān)機制研究.pdf

1、隨著人們對腫瘤的研究深入，腫瘤的微環(huán)境(micro-environment)在腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移中的作用越來越受到重視。研究發(fā)現(xiàn)，在腫瘤的微環(huán)境中，有多種免疫細(xì)胞募集，并參與了腫瘤免疫，包括巨噬細(xì)胞。存在于腫瘤微環(huán)境中的巨噬細(xì)胞，被稱為腫瘤相關(guān)性巨噬細(xì)胞(Tumor-associated macrophages，TAMs)。
　　 巨噬細(xì)胞具有可塑性，在不同的環(huán)境中，可以分化為不同的亞群，如M1，M2，其在免疫功能上存在顯著差異[1-

2、3]。M1通過經(jīng)典的激活途徑，即通過Toll-like受體(TLRs)與抗原結(jié)合后，產(chǎn)生IL-12。IL-12使幼稚的T細(xì)胞向Ⅰ型輔助性T細(xì)胞(Th1)分化，并使T細(xì)胞及NK細(xì)胞產(chǎn)生釋放IFN-γ。IFN-γ作為第二信號，可進一步激活巨噬細(xì)胞并增強巨噬細(xì)胞分泌細(xì)胞因子及抗原遞呈的能力，同時分泌大量促炎因子，具有促進免疫的作用。M2則通過非經(jīng)典途徑激活，具體機制現(xiàn)在仍不清楚。其激活的巨噬細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子具有炎癥抑制作用，主要為IL-10

3、，TGF-β等[4，5]。
　　 腫瘤對各種浸潤的炎性細(xì)胞，具有誘導(dǎo)分化作用(re-education)，表現(xiàn)出特定的免疫細(xì)胞亞型。在對TAMs的研究發(fā)現(xiàn)，其大部分表現(xiàn)為M2亞型，具有與M2相似的分子標(biāo)記(molecular marker)及細(xì)胞因子譜(cytokine profile)[6]。常用的TAMs分子標(biāo)記如CD163[5，7，8]，CD206[9-11]及CD204[12，13]等。TAMs對腫瘤的作用目前仍存在爭議

4、。一部分研究發(fā)現(xiàn)，TAMs具有抗腫瘤作用(anti-tumor)，而多數(shù)研究則認(rèn)為，TAMs可促進腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移以及促進腫瘤血管新生等，從而促進腫瘤進展(pro-tumor)[14-16]。
　　 胃癌是我國最為常見的腫瘤之一，但目前對于胃癌的微環(huán)境中的TAMs相關(guān)研究較少。本研究通過收集臨床手術(shù)病例及標(biāo)本，制作組織芯片，用免疫組化的方法，以CD163作為TAMs標(biāo)記，觀察胃癌組織中TAMs的浸潤情況，研究其與腫瘤的病理分化、

5、臨床分期以及預(yù)后的關(guān)系，以分析其對胃癌進展的作用。
　　 上皮間質(zhì)化(Epithelial-mesenchymal transition，EMT)是在組織胚胎發(fā)育中對形態(tài)形成起關(guān)鍵作用的過程。在EMT過程中，上皮細(xì)胞失去細(xì)胞間的緊密連接及細(xì)胞極性，形成具有間質(zhì)細(xì)胞特征的梭形細(xì)胞[17]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤的EMT效應(yīng)是腫瘤進展的重要機制，并受到腫瘤微環(huán)境的調(diào)控[18，19]。腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT反應(yīng)后，細(xì)胞形態(tài)出現(xiàn)間質(zhì)化，并且遷

6、移侵襲能力將明顯增強。TAMs是腫瘤微環(huán)境的重要組成部分，而TAMs對腫瘤的EMT效應(yīng)研究較少。因此我們通過實驗分析TAMs對胃癌的EMT效應(yīng)，以進一步探討其對胃癌進展的相關(guān)機制。
　　 第一部分腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞對胃癌根治術(shù)后患者生存的影響
　　 本部分研究主要是探討腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(Tumor-associated macrophages，TAMs)在胃癌組織中的浸潤情況以及其與胃癌患者的臨床及病理指標(biāo)之間的關(guān)系，分析

7、其對行根治術(shù)后胃癌患者的預(yù)后影響。
　　 收集135例于1999年2月-2005年12月期間在本院普外科胃癌組行D2根治術(shù)、達到R0切除的胃腺癌患者病例資料，并將手術(shù)切除標(biāo)本制作組織芯片。通過免疫組化染色，以CD163標(biāo)記TAMs，通過電腦圖像分析系統(tǒng)及圖像分析軟件，計數(shù)陽性細(xì)胞個數(shù)及細(xì)胞密度。統(tǒng)計分析其浸潤的細(xì)胞密度與患者的臨床指標(biāo)、胃癌的分化程度、以及病理分期的關(guān)系；并且進一步分析其對胃癌術(shù)后患者生存的影響。
　　

8、結(jié)果發(fā)現(xiàn)，胃癌組織中TAMs的細(xì)胞密度均明顯高于正常胃壁組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.001)；以胃癌組織中TAMs的細(xì)胞密度中位值(M=7.48)將胃癌患者分為高表達組(n=68)及低表達組(n=67)，通過x2檢驗分析發(fā)現(xiàn)胃癌組織中TAMs表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，高表達組淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率較低表達組高，具有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.025)。TAMs表達與胃癌的T分期具有一定相關(guān)趨勢，但無統(tǒng)計學(xué)意義，而胃癌患者的年齡、性別、腫瘤的大小及部位、細(xì)

9、胞分化程度與胃癌組織TAMs的細(xì)胞密度均無相關(guān)性。通過COX單因素分析發(fā)現(xiàn)，胃癌患者的預(yù)后與胃癌的浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及胃癌組織中TAMs的細(xì)胞密度相關(guān)(P=0.032)。通過Kaplan-Meier生存分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，胃癌組織中TAMs高表達組的總生存期(OS)短于TAMs低表達組(p=0.028)。TAMs高表達組患者的一年、三年、五年的生存率分別是81％、69％、56％；而低表達組患者的一年、三年、五年的生存率分別是88％、81％

10、、77％。但在多因素分析中顯示胃癌組織中TAMs表達不是獨立的預(yù)后因素。
　　 第二部分 THP-1來源的巨噬細(xì)胞對胃癌細(xì)胞生物學(xué)作用的觀察研究
　　 本部分實驗通過THP-1來源的巨噬細(xì)胞模擬TAMs的作用，觀察THP-1來源的巨噬細(xì)胞對胃癌細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)、增殖潛能以及侵襲能力的影響，進一步探討TAMs對胃癌進展的相關(guān)作用。
　　 通過將THP-1細(xì)胞予phorbol myristate acetate(PMA

11、)體外誘導(dǎo)的方法，使其分化為巨噬細(xì)胞，并且用transwell小室將胃癌細(xì)胞株AGS細(xì)胞和GSC-7901細(xì)胞分別與該巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)模擬其相關(guān)微環(huán)境，觀察胃癌細(xì)胞生長情況及細(xì)胞形態(tài)的變化。通過全自動活細(xì)胞觀測分析系統(tǒng)(Cell-IQ)及cck-8增殖實驗分析THP-1來源的巨噬細(xì)胞對胃癌細(xì)胞的增殖能力的影響；并采用Matrigel體外侵襲實驗觀察胃癌細(xì)胞株AGS及SGC-7901細(xì)胞與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)及未共培養(yǎng)的情況下體外侵襲能力的變化，

12、同時用Western-blot檢測其基質(zhì)金屬蛋白酶(matrixmetaloproteinases，MMPs)表達差異進一步說明侵襲能力的改變。
　　 結(jié)果顯示，胃癌細(xì)胞與THP-1來源的巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)后，發(fā)生了上皮間質(zhì)化(Epithelial-mesenchymal transition，EMT)反應(yīng)。細(xì)胞形態(tài)由原來上皮細(xì)胞形態(tài)轉(zhuǎn)化成為一種間質(zhì)細(xì)胞形態(tài)的梭形細(xì)胞。細(xì)胞生長分散，細(xì)胞間隙增大。與THP-1來源的巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)后，

13、兩種胃癌細(xì)胞(AGS和SGC-7901胃癌細(xì)胞株)體外侵襲能力均有明顯增強。共培養(yǎng)后與未共培養(yǎng)的AGS細(xì)胞穿出小室的細(xì)胞數(shù)分別為308±15和168±4，P<0.01；SGC-7901細(xì)胞為433±77和106±11，P<0.05。而這兩種胃癌細(xì)胞的增殖能力共培養(yǎng)處理后均未增強。腫瘤細(xì)胞的侵襲力與其分泌MMPs的能力密切相關(guān)。AGS細(xì)胞共培養(yǎng)處理后MMP7及MMP9表達明顯上調(diào)，而SGC-7901細(xì)胞共培養(yǎng)后也可見MMP7表達上調(diào)，驗證

14、了THP-1來源的巨噬細(xì)胞增強了胃癌細(xì)胞的侵襲力。
　　 實驗結(jié)果提示TAMs對胃癌細(xì)胞具有EMT效應(yīng)，能增強胃癌細(xì)胞的侵襲力，而使胃癌發(fā)生進展。
　　 第三部分 THP-1來源的巨噬細(xì)胞促進胃癌細(xì)胞EMT反應(yīng)的相關(guān)機制研究
　　 上一部分的實驗表明，THP-1來源的巨噬細(xì)胞能使胃癌細(xì)胞發(fā)生EMT反應(yīng)，增強胃癌細(xì)胞的侵襲能力。本部分實驗進一步探討THP-1來源的巨噬細(xì)胞促進胃癌細(xì)胞EMT轉(zhuǎn)化的可能相關(guān)分子機制及信

15、號通路。
　　 在調(diào)控EMT效應(yīng)的諸多轉(zhuǎn)錄因子中，Snail/Slug的作用最為重要。Snail/Slug可直接抑制E-cadherin轉(zhuǎn)錄，使細(xì)胞發(fā)生EMT轉(zhuǎn)化。通過qRT-PCR發(fā)現(xiàn)，胃癌細(xì)胞中Snail和Slug的基因表達水平在與THP-1來源的巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)后均有不同程度上調(diào)。共培養(yǎng)后，胃癌細(xì)胞SGC-7901中Snail的基因表達增加了4倍(P<0.01)，而Slug的表達則增加了24倍(P<0.01)；AGS細(xì)胞中S

16、lug的表達也上調(diào)至對照細(xì)胞的1.5倍(P<0.05)。提示，THP-1來源的巨噬細(xì)胞可能通過上調(diào)胃癌細(xì)胞中Snail/Slug的基因表達，而使胃癌細(xì)胞發(fā)生EMT轉(zhuǎn)化。
　　 GSK-3β具有抑制Snail/Slug基因轉(zhuǎn)錄的生物活性，并可在Akt(主要活化形式為p-Akt Ser473)的作用下發(fā)生磷酸化(p-GSK-3βser9)而失活。實驗通過Western-blot檢測發(fā)現(xiàn)，用THP-1來源的巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)處理后，AGS

17、細(xì)胞和SGC-7901細(xì)胞中p-GSK-3βser9和p-Akt Ser473表達水平與未共培養(yǎng)相比，明顯增高；總的GSK-3β和Akt表達則相似，無明顯差異。結(jié)果提示，THP-1來源的巨噬細(xì)胞能上調(diào)胃癌細(xì)胞Akt/GSK-3β通路的磷酸化水平而使GSK-3β的活性減弱，削弱其對Snail/Slug基因表達的抑制。Akt/GSK-3β/Snail(Slug)軸可能與THP-1來源的巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的EMT作用相關(guān)。
　　 由于共培養(yǎng)

18、體系中巨噬細(xì)胞與胃癌細(xì)胞無直接接觸，巨噬細(xì)胞對胃癌細(xì)胞的作用主要通過其分泌的可溶性分子而引起的。通過熒光磁珠免疫分析(Fluorescent bead immunoassay)的方法檢測發(fā)現(xiàn)，THP-1細(xì)胞在PMA誘導(dǎo)激活并分化為巨噬細(xì)胞后，TNF-α表達量增加了8倍(P=0.056)，而IL-1β和IL-8表達量分別增加了20倍和40倍(P均小于0.01)。這些明顯增高的細(xì)胞因子可能參與了胃癌細(xì)胞的EMT轉(zhuǎn)化，但還需進一步實驗證實。<

19、br>　　 結(jié)論
　　 1.胃癌組織中TAMs的細(xì)胞密度與胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移正相關(guān)，并對胃癌術(shù)后患者有一定的預(yù)后預(yù)測價值。
　　 2.THP-1來源的巨噬細(xì)胞促使胃癌細(xì)胞發(fā)生EMT轉(zhuǎn)化，增強了胃癌細(xì)胞侵襲力，其對胃癌細(xì)胞的EMT效應(yīng)可能與Akt/GSK-3β/Snail(Slug)通路相關(guān)。
　　 3.THP-1細(xì)胞激活分化為巨噬細(xì)胞后，TNF-α、IL-1β和IL-8表示明顯上調(diào)，這些細(xì)胞因子可能介導(dǎo)了胃癌細(xì)胞的