腫瘤相關成纖維細胞來源的外泌體在肝癌增殖和轉移中的作用及相關機制的研究.pdf

1、背景：肝細胞肝癌是預后較差的一類腫瘤，其致死率居所有腫瘤的第三位。肝細胞肝癌的致病因素十分復雜，主要包括病毒、真菌感染、酒精等因素導致基因突變，原癌基因激活，抑癌基因沉默。近十幾年來的研究表明，腫瘤的發(fā)生發(fā)展并不僅僅是腫瘤細胞本身癌基因或是抑癌基因的改變，腫瘤周圍的微環(huán)境同樣作為“共犯”參與了腫瘤的惡性轉化。腫瘤的微環(huán)境中主要的細胞種類可以分為3類：血管生成細胞，浸潤的免疫細胞，腫瘤相關的成纖維細胞。這三類細胞均能夠與腫瘤細胞通過相互作

2、用，參與對腫瘤細胞“腫瘤印記”的改變過程。
　　腫瘤相關的成纖維細胞是腫瘤微環(huán)境中一類重要的非實質細胞，高表達alpha-SMA和纖維活化蛋白FAP，分泌多種細胞因子如HGF，EGF，IGF，F(xiàn)GF，SDF-1等參與腫瘤細胞增殖和EMT轉化過程，并能夠通過分泌大量的基質成分、膠原和纖黏連蛋白等參與腫瘤微環(huán)境的重塑。
　　外泌體是一種直徑在30-150nm的囊泡結構，其中包含多種內容物，如蛋白質（細胞因子，膜受體，受體的配體等

3、等），核酸類物質（如DNA，mRNA，miRNA, LncRNA）以及脂質，其組成成分能夠影響受體靶細胞。近年來的研究表明，腫瘤相關的成纖維細胞能夠通過分泌外泌體與腫瘤細胞相互交流。而腫瘤相關的成纖維細胞與正常成纖維細相比其miRNA的表達譜差異十分明顯。那么腫瘤相關成纖維細胞來源的外泌體中miRNAs是否同樣存在不同的表達豐度，是否參與調控了腫瘤細胞的生物學行為的改變？
　　目的：
　　1.探討肝癌組織中腫瘤相關成纖維細胞

4、與癌旁組織中成纖維細胞來源外泌體中的miRNAs的差異表達情況，并篩選出候選miRNA進行功能學驗證
　　2.探討差異表達的miR-320a對肝癌細胞惡性生物學表型的影響
　　3.研究miR-320a參與調控肝癌細胞惡性改變的分子機制
　　方法：
　　1.首先分離6對肝癌及癌旁組織中原代的腫瘤相關成纖維細胞（CAFs）和癌旁成纖維細胞（PAFs），通過提取兩種成纖維細胞分泌的外泌體，通過PCR擴增獲取最終的Cdn

5、a文庫，進而對其中的miRNAs進行miRNAs測序后篩選出了差異表達的miRNA。
　　2.通過體外共培養(yǎng)和體內裸鼠皮下成瘤，在CAFs中過表達miR-320a，觀察是否能夠通過外泌體傳遞至肝癌細胞并發(fā)揮功能。
　　3.利用慢病毒在肝癌細胞系中過表達miR-320a，通過CCK-8，平板克隆，Transwell及劃痕實驗驗證，miR-320a對肝癌細胞生物學表型的影響。
　　4.通過體內皮下成瘤實驗，檢測miR-32

6、0a對肝癌細胞增殖能力的影響；通過裸鼠尾靜脈，檢測miR-320a對肝癌細胞肺轉移能力的影響。
　　5.利用生物信息預測軟件結合熒光素酶報告基因檢測驗證miR-320a的靶基因。通過western blot，免疫組織化學和原位雜交試驗，驗證miR-320a下游分子通路。
　　結果：
　　1.成功分離培養(yǎng)了肝癌組織來源的腫瘤相關成纖維細胞（CAFs）及癌旁組織成纖維細胞（PAFs），并對其生物學特征及表面分子標記進行了驗

7、證。相對于PAFs，CAFs細胞表達更強的alpha-SMA和FAP，但是PDGF-beta的表達并無明顯的差異。成功分離了CAFs及PAFs細胞分泌的外泌體，并對其進行了鑒定。通過構建miRNAs文庫，進行測序。測序結果表明CAFs來源的外泌體中存在大量下調的促腫瘤miRNAs。共有42個下調，2個上調miRNA存在顯著性差異，通過比較差異表達的miRNAs的表達量及差異倍數(shù)，最終篩選出miR-320a作為后續(xù)研究。
　　2.通

8、過體外間接共培養(yǎng)模型證實，成纖維細胞能夠將cy3標記的miR-320a通過外泌體轉運至肝癌細胞，在肝癌細胞中表達紅色熒光。將過表達miR-320a的成纖維細胞與腫瘤細胞共培養(yǎng)，qRT-PCR結果提示，MHCC97-H細胞中miR-320a的表達上調。同時體內實驗證實，過表達miR-320a的成纖維細胞能夠在體抑制肝癌細胞的成瘤，小動物活體成像結果提示熒光強度明顯低于對照組。
　　3.通過CCK-8、平板克隆實驗證實過表達miR-3

9、20a后能夠抑制肝癌細胞的增殖能力；miR-320a能夠是肝癌細胞系細胞周期阻滯于G1期。通過Transwell及劃痕實驗證實過表達miR-320a后能夠抑制肝癌細胞侵襲和轉移能力。進一步裸鼠成瘤實驗，及裸鼠尾靜脈肺轉移模型證實了體外實驗的結論。
　　4.利用生物分析軟件(TargetScan,CLIP-Seq,miRDB and miRanda)預測了miR-320a的下游靶基因PBX3。通過恢復性實驗驗證證實，miR-320a

10、能夠通過PBX3參與調控肝癌細胞MHCC97-H和SMM7721的增殖，侵襲和轉移能力。進一步證實，PBX3可以通過影響ERK1/2磷酸化水平，參與調節(jié)了CDK2，MMP2以及EMT的相關標記物的表達。
　　綜上，我們認為腫瘤組織中CAFs分泌外泌體中的miR-320a表達下降，會引起其中的促腫瘤成分和抑腫瘤成分的平衡失調，為肝癌細胞提供了更有利于其生長轉移的環(huán)境，進而介導肝癌的惡性轉變。而通過在CAFs中過表達miR-320a能