腫瘤來源的外泌體在耐失巢凋亡肝癌細胞自我種植中的作用及其機制研究.pdf

1、實驗目的:
　　肝細胞肝癌是全球范圍內(nèi)最常見的惡性腫瘤之一，其術后高復發(fā)率是制約肝癌治療效果的首要因素。其中在循環(huán)系統(tǒng)中耐失巢凋亡的肝癌循環(huán)腫瘤細胞在肝癌的復發(fā)轉(zhuǎn)移中起到了重要作用。腫瘤細胞脫落入血已被證實發(fā)生于腫瘤形成的早期，然而，并非所有進入循環(huán)的腫瘤細胞都會形成轉(zhuǎn)移灶，這取決于耐失巢凋亡腫瘤細胞的生物學特性、定植器官的微環(huán)境及機體的免疫狀態(tài)等因素。本研究的目的就是觀察耐失巢凋亡肝癌細胞的腫瘤自我種植現(xiàn)象，以及腫瘤來源的外泌體

2、在肝癌細胞自我種植中的作用及內(nèi)在機制。
　　材料與方法:
　　本研究通過polyHEMA包被的低粘附培養(yǎng)板對正常肝癌細胞系HuH-7和HCCLM3進行長時間連續(xù)懸浮培養(yǎng)后獲得耐失巢凋亡的肝癌細胞株，通過細胞增殖實驗，流式細胞術檢測凋亡、Transwell實驗等方法，觀察耐失巢凋亡肝癌細胞株細胞株的增殖能力、抗凋亡能力、侵襲轉(zhuǎn)移能力等生物學特性的變化。通過構(gòu)建裸鼠肝癌原位荷瘤模型，觀察耐失巢凋亡的肝癌細胞在體內(nèi)的腫瘤自我種植現(xiàn)

3、象。在體外通過提取不同組織來源細胞的分泌物及分泌物不同成分檢測其對耐失巢凋亡肝癌細胞穿內(nèi)皮細胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響。在機制上，利用microRNA芯片技術對不同細胞來源外泌體中microRNA表達檢測進行檢測，同時對外泌體共培養(yǎng)后耐失巢凋亡肝癌mRNA的表達譜進行檢測，結(jié)合兩者結(jié)果預測外泌體中mircoRNA對耐失巢凋亡肝癌細胞穿內(nèi)皮細胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的調(diào)節(jié)，并進一步通過microRNA干擾技術在相應的耐失巢凋亡肝癌細胞中進行驗證。

4、　　結(jié)果:
　　實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)(1)肝癌細胞系HuH-7和HCCLM3隨著失巢培養(yǎng)時間的遞增逐漸聚集成團。(2)耐失巢凋亡肝癌細胞的遷移能力明顯增強而侵襲能力無明顯變化，在失巢環(huán)境中再次分散成單細胞時耐失巢凋亡細胞株具有較快聚集成團能力，且抗失巢凋亡能力顯著增強。耐失巢凋亡肝癌細胞恢復貼壁培養(yǎng)后細胞增殖能力無明顯變化。(3)耐失巢凋亡肝癌細胞通過靜脈注射進入肝癌原位荷瘤裸鼠的體內(nèi)28d后可以觀察到腫瘤自我種植現(xiàn)象。(4)腫瘤細胞來源

5、的分泌物能明顯增強耐失巢凋亡肝癌細胞的穿內(nèi)皮細胞轉(zhuǎn)移侵襲能力。(5)腫瘤細胞來源的分泌物中外泌體能顯著增強耐失巢凋亡肝癌細胞的穿內(nèi)皮細胞轉(zhuǎn)移侵襲能力，而細胞因子等其他分泌物作用不明顯。(6)外泌體對耐失巢凋亡細胞的調(diào)節(jié)作用是通過細胞胞吞作用實現(xiàn)的。(7)不同細胞來源外泌體的microRNA芯片檢測共篩選出20條在HuH-7細胞外泌體中高表達的與細胞侵襲轉(zhuǎn)移能力相關的microRNA。(8)外泌體共培養(yǎng)后耐失巢凋亡肝癌mRNA的表達譜進行

6、檢測共篩選出17個表達下調(diào)的基因。(9)腫瘤來源的外泌體中含有的miR-25-5p在調(diào)節(jié)耐失巢凋亡肝癌細胞穿內(nèi)皮細胞遷移侵襲能力方面起到了重要作用。(10)外泌體與耐失巢凋亡肝癌共培養(yǎng)后LRRC7表達下降，應用miR-25-5p抑制劑后LRRC7表達上調(diào)。
　　結(jié)論:
　　綜上所述，我們通過細胞失巢培養(yǎng)模型，建立了耐失巢凋亡肝癌細胞株。這一細胞亞株在生物學行為方面與來源的肝癌細胞系相比發(fā)生了一定的變化。該類細胞在失巢環(huán)境中細