間充質干細胞來源外泌體促進椎間盤退變修復的作用及機制研究.pdf

1、[研究背景與目的]
　　下腰痛(Low Back Pain)及頸肩痛(Neck pain)作為現(xiàn)代社會最為常見的疾患之一，嚴重影響著人們的生活質量。流行病學調查顯示大約超過80％的人，一生中有過一次或多次下腰痛或肩頸痛的經歷，其中超過15％的人其嚴重程度需要住院治療才能達到緩解。作為醫(yī)院門診患者就診的常見病因之一，每年因上述癥狀造成的直接或間接社會經濟損失巨大。目前對于引起下腰痛及頸肩痛主要的病因學研究顯示，超過40％的下腰痛及2

2、0％的頸肩痛患者主要是由于他們的椎間盤退變(IntervertebralDisc Degeneration，簡稱IDD)及IDD所繼發(fā)的一系列病變導致的。對于IDD患者而言，目前有效的治療方法離不開外科手術對退變椎間盤的切除治療。然而在切除退變椎間盤的同時需要植入融合器并予螺釘固定，在犧牲患者脊柱活動度的同時給患者經濟上帶來嚴重的負擔。因此，尋找新的椎間盤退變治療或椎間盤再生的方法一直是該領域的研究熱點之一。
　　隨著干細胞研究領

3、域的發(fā)展，以干細胞為主的再生醫(yī)學以及生物治療方法引起學者廣泛關注。通過使用干細胞移植、組織工程移植和改變局部微環(huán)境誘導干細胞再生等創(chuàng)新的醫(yī)療手段的幫助下，能夠達到修復受損的組織、重建病變等目的。目前研究較多的具有組織再生及修復能力的細胞中，由于間充質干細胞(MSC)的獲取相對容易、分化能力強以及研究較為深入等原因使其成為應用最為廣泛而可靠的種子細胞，是目前再生醫(yī)學的研究熱點之一。以MSC為主的再生醫(yī)學治療方式有望為椎間盤退變患者帶來手術

4、以外的另一種治療選擇。但幾乎所有MSC等干細胞都存在有創(chuàng)采集、分離數(shù)量少、年齡依賴性強及體外擴增能力有限等缺點極大限制其臨床應用。作為能夠起到治療作用的多能干細胞，其在人體內正常新陳代謝的過程中其數(shù)量會不斷減少、修復能力不斷減弱。其次，由于其數(shù)量稀少，在采集與體外擴增時常會混入非干細胞的成體細胞，最終在體外擴增及治療中影響干細胞的純度以及療效。再者，以MSC為主的成體多能干細胞，其在體外擴增的過程中亦會不斷發(fā)生細胞衰老(Senescen

5、ce)，并在此過程中喪失其多向分化潛能。而在椎間盤退變方面，由于髓核的結構特殊使得其內環(huán)境處于低氧且營養(yǎng)物質匱乏的狀態(tài)，傳統(tǒng)的MSC移植后成活效率較低。此外，由于髓核體積小、周圍有堅固的纖維環(huán)包裹、含水量多等特點，使其僅可容納少量的MSC進入髓核，極大限制了其治療的效果。綜上所述，對于椎間盤退變的再生醫(yī)學治療而言，迫切需要尋找一種易獲取、形狀穩(wěn)定、免疫原性低、修復效果好的干細胞替代物來彌補上述的不足。
　　為了尋找合適的干細胞替代

6、物，學者們從干細胞修復受損組織或促進組織再生的機理方面進行了深入的研究，并發(fā)現(xiàn)MSC不僅通過自身增殖分化替代受損組織，更可以通過旁分泌重要的微環(huán)境調控物質——外泌體(Exosomes)來改變受損組織周圍微環(huán)境，從而調控細胞增殖、分化、凋亡等生物學功能，間接實現(xiàn)修復治療作用。外泌體(Exosomes)是細胞通過出芽方式分泌的納米級(40-120nm)雙層膜結構的囊性小泡。由于其具有如同細胞膜般的雙層磷脂膜結構，因此具有良好的滲透性與穩(wěn)定性

7、，能夠與靶細胞進行融合;其內富含細胞來源的mRNA、miRNA以及蛋白質成分，且上述成分能夠在參入靶細胞后對靶細胞的功能及信號起到重要的調控作用;由于近乎所有細胞均會分析外泌體，而不同細胞來源外泌體內成分差異較大，因此其被認為是重要的局部微環(huán)境調控介質，同時也是干細胞對諸多臟器修復起作用的重要成分。目前已有許多文獻報道MSC來源外泌體具有與MSC相似的功能，如其能夠對損傷的組織進行修復、抑制炎癥反應、調節(jié)免疫反應等。與單純MSC應用相比

8、，MSC外泌體具有諸多的應用優(yōu)勢，如性質穩(wěn)定、易于保存、沒有免疫原性、獲取容易且方便改造等諸多優(yōu)勢，為多種疾病的治療提供了新的手段。而具有上述特點的MSC來源外泌體可能成為彌補傳統(tǒng)MSC治療方法在椎間盤退變修復中的不足的理想替代物。
　　課題組在前期研究中已經發(fā)現(xiàn)MSC來源外泌體能夠顯著促進髓核細胞ECM的合成。作為髓核ECM重要合成酶，CHSY同時參與多種疾病的發(fā)生發(fā)展過程中。CHSY的功能異常會導致硫酸軟骨素(CS)的合成減少

9、，其與IDD的發(fā)生亦密切相關。基于上述內容，我們推測MSC來源的外泌體可能通過激活髓核細胞ECM合成相關酶CHSY的表達來促進椎間盤的修復。
　　第一部分:間充質干細胞外泌體的分離與鑒定
　　方法:(1)將將沖洗下來的液體制成單細胞懸液，經過商品化Percoll密度梯度離心劑離心分離和收集有核細胞，再利用含15％胎牛血清的DMEN培養(yǎng)基重懸管中細胞進行骨髓間充質干細胞進行原代培養(yǎng)。(2)利用流式細胞儀器檢測CD105，CD3

10、4，CD44，CD14，CD90，CD45，CD19等間充質干細胞表面標志物的表達;利用商品化成骨、成脂分化誘導培養(yǎng)基對細胞進行誘導鑒定。(3)將二代后的MSC細胞于T75以上培養(yǎng)瓶中進行擴增。待細胞達到90％融合度時更換低血清培養(yǎng)基，通過每兩天一次收集培養(yǎng)基的方式進行連續(xù)收集，利用超速離心機對收集的上清液進行外泌體體離心純化。(4)通過SDS-PAGE電泳及Western-Blot檢測外泌體中特定的蛋白表達情況。通過透射電鏡或Nano

11、sight可以分析外泌體的大小、形態(tài)。(5)利用PKH67實驗明確外泌體的融合能力。
　　結果:(1)通過8例骨髓收集，成功進行骨髓來源MSC原代培養(yǎng)7例，均狀態(tài)良好。(2)流式細胞學檢測MSC標志物CD105，CD34，CD44，CD14，CD90，CD45，CD19示原代培養(yǎng)MSC符合國際界定MSC指標。成骨及成脂誘導后，原代培養(yǎng)MSC顯示出明顯的鈣結節(jié)及脂肪滴。(3)通過大量培養(yǎng)MSC并收集上清進行超速離心，獲得明顯的沉淀并

12、進行再次離心純化。(4)通過Western Blot檢測發(fā)現(xiàn)收集得到的沉淀物表達外泌體特異性CD81及CD63，Nanosight及電鏡檢測均顯示收集得到的沉淀為外泌體。(5)利用PKH67染料染色外泌體并加入至MSC中，結果顯示MSC能夠被外泌體染色，提示收集得到的外泌體具有膜融合能力。
　　結論:我們通過骨髓MSC細胞的原代培養(yǎng)獲得了符合國際標準的骨髓MSC細胞。對原代MSC細胞進行擴增及上清的收集后，利用超速離心的方法能夠得

13、到較為純的外泌體。同時利用外泌體標記物及功能實驗明確收集得到的確為外泌體。
　　第二部分:間充質干細胞來源外泌體對退變椎間盤的影響
　　方法:(1)收集30-50年齡段的正常髓核組織進行原代培養(yǎng)。(2)利用超速離心后的上清液作為去外泌體上清作組，即對照組;利用未培養(yǎng)過細胞的原始培養(yǎng)基通過超速離心作為空白對照組;利用HEK293細胞的培養(yǎng)上清進行外泌體的分離，得到的外泌體作為陰性對照組;而MSC來源外泌體作為實驗組處理原代髓核

14、細胞。(3)通過加入蛋白定量后不同濃度的上述樣品至髓核細胞，培養(yǎng)24h后通過PCR、Western Blot以檢測處理后髓核細胞細胞外基質分泌表達情況。(4)通過加入定量后不同濃度的上述分組樣品至髓核細胞，培養(yǎng)24h后通過PCR、Western Blot檢測處理后髓核細胞ECM降解相關MMP、ADAMTS的表達情況。(5)同上處理后通過PCR、Western Blot檢測處理后髓核細胞ECM合成相關CHSY等酶的表達情況。
　　結

15、果:(1)通過原代培養(yǎng)髓核組織，成功建立體外髓核細胞系6株。(2)成功收集MSC培養(yǎng)上清分離得到的外泌體、去外泌體上清、原始培養(yǎng)基以及HEK293來源外泌體。(3)分組處理后實驗組髓核細胞其2型膠原、蛋白聚糖表達量均高于對照組及陰性對照組。(4)分組處理后實驗組髓核細胞MMP1、MMP2、MMP7表達較對照組及陰性對照組出現(xiàn)顯著下調。(5)分組處理后實驗組髓核細胞CHSY1、CHSY2、CHSY3表達較對照組及陰性對照組出現(xiàn)顯著上調。<

16、br>　　結論:通過原代培養(yǎng)髓核組織獲得正常人髓核細胞株5株。通過BCA法對分組樣品進行定量，定量后處理細胞發(fā)現(xiàn)MSC來源外泌體具有上調髓核細胞ECM合成酶以及ECM合成的作用，并降低ECM降解酶的表達。
　　第三部分:MSC外泌體通過上調CHSY保護椎間盤髓核細胞
　　方法:(1)利用高通量RNA測序技術檢測外泌體處理后髓核細胞的轉錄組表達變化。(2)生物信息學分析MSC來源外泌體促進髓核細胞ECM合成酶的機制。(3)利用

17、高通量測序技術檢測外泌體中的microRNA分子，并篩選與CHSY結合的椎間盤退變相關miRNA并通過雙熒光素酶報告基因實驗驗證。(4)過表達預測的候選miRNA，研究其對CHSY以及髓核細胞ECM分泌的變化。(5)雙熒光素酶實驗明確外泌體內microRNA對CHSY的靶向機制。
　　結果:(1)利用高通量轉錄組測序技術發(fā)現(xiàn)MSC外泌體處理后髓核細胞轉錄組水平基因表達與對照組相比存在顯著差異。(2)利用GO分析發(fā)現(xiàn)MSC外泌體能夠

18、顯著影響髓核細胞轉錄后調控因子的改變，提示外泌體促進CHSY的表達可能與轉錄后調控有關。(3)利用高通量miRNA測序技術發(fā)現(xiàn)MSC來源外泌體較對照及HEK293外泌體具有較高的microRNA表達。(4)靶基因預測分析發(fā)現(xiàn)MSC外泌體內含有能夠顯著抑制CHSY負向調控因子，IL-1以及TNF-α通路下游因子NF-κB的miRNA。(5)靶向實驗驗證了MSC外泌體中的候選miRNA能夠直接抑制NF-κB的表達，從而促進CHSY降低MMP

19、的表達。
　　結論:利用高通量檢測聯(lián)合生物信息學分析，我們發(fā)現(xiàn)了MSC來源外泌體能夠顯著提高髓核細胞轉路后調控因子的表達，意味著miRNA等轉錄后調控因子與外泌體促進IDD中ECM合成密切相關。利用高通量miRNA組分析MSC來源外泌體并結合生物信息學預測技術，我們發(fā)現(xiàn)了一批CHSY抑制性NF-κB的靶向性miRNA，并利用相應實驗對其進行了驗證。
　　小結：
　　本研究通過探究MSC來源外泌體對髓核細胞的作用，利用高

20、通量轉錄組及miRNA組學分析手段，首次發(fā)現(xiàn)了髓核細胞退變引起的ECM合成酶的降低主要是通過IL/TNF等促炎因子誘導的CHSY靶向性miRNA引起的。我們發(fā)現(xiàn)了miR-194、miR-515在IDD中發(fā)現(xiàn)顯著上調，而通過功能學驗證明確了上述miRNA確實能夠引起CHSY表達的變化，而且上述miRNA還直接受到IL/TNF的調控。通過上述研究啟發(fā)了關于CHSY的調控機制。在MSC外泌體提高CHSY表達的發(fā)現(xiàn)基礎上，我們進一步針對外泌體中