真皮來源間充質(zhì)細(xì)胞移植促進(jìn)小鼠肝損傷修復(fù)的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、肝臟是具有高度再生能力且能對外界損傷發(fā)揮生物學(xué)防御功能的重要器官。然而當(dāng)外界損傷程度加劇繼而導(dǎo)致肝臟發(fā)生功能障礙時(shí)，肝臟固有再生潛能將會被抑制，從而導(dǎo)致包括肝功能衰竭在內(nèi)的嚴(yán)重后果。目前，終末期肝病患者的死亡率高。對于多數(shù)嚴(yán)重的肝臟疾病來說，仍然沒有十分有效的治療手段。雖然肝移植是終末期肝病患者的主要治療手段，其4年存活率≥70％，但由于其供體器官來源相對緊缺、移植費(fèi)用相對昂貴以及存在較高移植物排斥反應(yīng)等因素而限制了其進(jìn)一步在肝臟疾病治

2、療領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用。間充質(zhì)干細(xì)胞/基質(zhì)細(xì)胞(MSCs)具有分化及轉(zhuǎn)分化為多種類型細(xì)胞、刺激機(jī)體再生和修復(fù)損傷組織/器官的能力，以MSCs為主的細(xì)胞治療近年來已在不同臟器的再生醫(yī)學(xué)相關(guān)領(lǐng)域廣泛地開展研究。研究人員已經(jīng)發(fā)現(xiàn)骨髓來源的間充質(zhì)干細(xì)胞移植能有效的緩解實(shí)驗(yàn)性肝衰竭并促進(jìn)肝臟再生。這被認(rèn)為是可替代肝移植治療肝臟疾病的潛在有效方法。已有Ⅰ期臨床試驗(yàn)表明移植骨髓來源的MSCs可以改善肝硬化患者的肝功能。相比于MSCs，不同組織特異性的間充質(zhì)

3、細(xì)胞同樣具有再生和免疫調(diào)節(jié)功能，可被應(yīng)用于細(xì)胞治療領(lǐng)域。
　　由表皮、真皮及其附屬器組成的皮膚被認(rèn)為是包括人類在內(nèi)的哺乳動物的最大器官。既往研究表明皮膚真皮層內(nèi)存在著豐富的MSC樣細(xì)胞群。由于真皮分布廣泛且容易獲得，這些真皮來源的細(xì)胞被認(rèn)為是各種疾病進(jìn)行自體細(xì)胞治療的潛在來源。我們前期的研究已經(jīng)表明移植皮膚來源的間充質(zhì)細(xì)胞(DMCs)可促進(jìn)復(fù)合放射性損傷大鼠的存活和創(chuàng)面愈合。我們最近的研究表明DMCs移植可降低急性GVHD的發(fā)病率

4、和病情嚴(yán)重程度，也可促進(jìn)膿毒癥小鼠的存活。許多研究表明來源于皮膚真皮層的成纖維細(xì)胞可以被誘導(dǎo)分化為具有肝細(xì)胞特性和功能的細(xì)胞。然而，有關(guān)DMCs能否直接促進(jìn)肝損傷修復(fù)及DMCs對于不同類型肝損傷是否有治療潛能的問題都需進(jìn)一步研究探討。
　　目的：主要采用兩個(gè)肝損傷動物模型，對DMCs移植肝損傷的治療作用進(jìn)行研究。
　　方法：
　　1.DMCs移植對CCL4誘導(dǎo)小鼠肝纖維化修復(fù)作用的研究
　　1.1DMCs移植對C

5、CL4誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化水平的影響
　　通過天狼星紅染色、CollagenⅠ抗體免疫組化染色和肝組織羥脯氨酸含量測定等方法評價(jià)了DMCs移植對CCL4誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化水平的影響;
　　1.2DMCs移植對CCL4誘導(dǎo)肝纖維化小鼠肝功能的影響
　　通過受試小鼠血清肝功能檢測、小鼠肝組織切片的Ki67、PCK抗體免疫組化染色及肝組織切片TUNEL染色來評價(jià)了DMCs移植對CCL4誘導(dǎo)肝纖維化小鼠肝功能和肝組織再生的影響;

6、
　　1.3 DMCs移植改善小鼠肝纖維化的機(jī)制研究
　　通過Western Blot和免疫組化實(shí)驗(yàn)研究了DMCs移植對纖維化肝組織中自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)水平和肝纖維化關(guān)鍵分子TGF-β表達(dá)的影響。體外DMCs與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)試驗(yàn)中研究了DMCs對炎癥關(guān)鍵細(xì)胞巨噬細(xì)胞功能的影響。
　　2.DMCs移植對放射損傷小鼠肝內(nèi)的定植情況及其對急性肝損傷修復(fù)的研究
　　2.1DMCs移植對放射損傷小鼠的存活影響及DMCs在小

7、鼠各臟器的定植情況
　　觀察了DMCs移植對8Gy致死劑量放射損傷小鼠的存活有無促進(jìn)作用，并通過GFP抗體免疫組化染色試驗(yàn)研究了DMCs在急性放射損傷小鼠各個(gè)臟器的定植情況;
　　2.2DMCs移植放射損傷對小鼠肝功能的影響
　　通過受試小鼠血清肝功能檢測、血清CRP的ELISA檢測和小鼠肝組織切片H&E染色來評價(jià)了DMCs移植對急性放射損傷小鼠肝臟功能的影響;
　　2.3定植于放射小鼠肝內(nèi)真皮來源的細(xì)胞的特征研

8、究
　　通過免疫熒光雙標(biāo)染色研究了定植于放射損傷小鼠肝臟內(nèi)DMCs的表型，并進(jìn)一步探索了其生物學(xué)特性;通過基因芯片分析了DIECs、DMCs和BMMψ三者之間差異基因的表達(dá)情況。
　　結(jié)果：
　　1.DMCs移植對CCL4誘導(dǎo)小鼠肝纖維化修復(fù)作用的研究
　　1.1小鼠肝組織切片的天狼星紅染色、CollagenⅠ抗體免疫組化染色以及肝組織羥脯氨酸含量測定試驗(yàn)表明DMCs門靜脈移植能夠顯著改善CCL4誘導(dǎo)的小鼠肝纖維

9、化水平;GFP抗體免疫組化染色結(jié)果表明DMCs在肝纖維化小鼠的肝內(nèi)發(fā)生短暫定植而不是長期定植;
　　1.2受試小鼠血清肝功能檢測、小鼠肝組織切片的Ki67、PCK抗體免疫組化染色及肝組織切片TUNEL染色試驗(yàn)表明DMCs移植能夠改善小鼠肝功能和促進(jìn)小鼠肝組織再生、減緩肝內(nèi)細(xì)胞發(fā)生凋亡;
　　1.3 Western Blot和TGF-β抗體免疫組化染色結(jié)果表明DMCs移植可以通過促進(jìn)肝纖維化小鼠肝組織高表達(dá)自噬相關(guān)蛋白LC3b

10、和低表達(dá)p62并抑制了肝內(nèi)誘導(dǎo)纖維化發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵分子TGF-β的表達(dá)，進(jìn)而來改善受試小鼠肝纖維化水平;
　　1.4 DMCs與巨噬細(xì)胞體外共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)表明DMCs能夠抑制經(jīng)LPS刺激巨噬細(xì)胞RAW264.7分泌促炎因子IL-1β、IL-6和促進(jìn)其分泌抗炎因子IL-10，抑制經(jīng)LPS刺激RAW264.7和腹腔巨噬細(xì)胞的凋亡，促進(jìn)RAW264.7和腹腔巨噬細(xì)胞的體外遷移，促進(jìn)RAW264.7和腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬能力。同時(shí)DMCs腹腔移

11、植CLP小鼠試驗(yàn)也表明DMCs可促進(jìn)CLP小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬能力。
　　2.DMCs移植對放射損傷小鼠肝內(nèi)的定植情況及其對急性肝損傷修復(fù)的研究
　　2.1 DMCs移植能夠促進(jìn)8Gy致死劑量放射小鼠的存活;GFP抗體免疫組化染色試驗(yàn)表明移植的DMCs能夠選擇性地長期定植于放射損傷小鼠的肝內(nèi)，受試小鼠血清肝功能檢測、血清CRP的ELISA檢測和小鼠肝組織切片H&E染色試驗(yàn)表明DMCs移植具有一定的抗炎保護(hù)效應(yīng)，能夠改善放射

12、損傷小鼠肝功能，減緩放射損傷引起的肝細(xì)胞脂肪變性，即DMCs移植促進(jìn)了放射損傷小鼠肝組織的損傷修復(fù);
　　2.2通過免疫熒光雙標(biāo)染色結(jié)果表明長期定植于放射損傷小鼠肝的DMCs呈vimentin+、CD45+和F4/80+，在體熒光微球吞噬試驗(yàn)表明定植于放射損傷小鼠肝的DMCs具有吞噬功能，進(jìn)而提示該群細(xì)胞具有巨噬細(xì)胞樣表型;
　　2.3 Ki67&GFP免疫雙標(biāo)染色試驗(yàn)表明定植于放射損傷小鼠肝的DMCs的這群細(xì)胞具有增殖特性

13、，對其進(jìn)行體外培養(yǎng)也表明該群細(xì)胞增殖旺盛，進(jìn)而表明定植于放射損傷小鼠肝內(nèi)的DMCs在體內(nèi)及體外條件下均展現(xiàn)出穩(wěn)定增殖潛能;
　　2.4定植于放射損傷小鼠肝內(nèi)的那群真皮間充質(zhì)來源的巨噬細(xì)胞樣細(xì)胞與BMMψ及RAW264.7有著不同的性狀:具有巨噬細(xì)胞特性并能夠參與全身放射所引起的肝損傷修復(fù);獲得DIECs、 DMCs和BMMψ三種細(xì)胞差異基因表達(dá)譜
　　結(jié)論：
　　本課題采用小鼠慢性肝損傷和小鼠急性肝損傷這兩種動物模型以

14、研究DMCs移植對肝損傷的潛在治療作用。首先，我們采用CCL4誘導(dǎo)小鼠肝纖維化模型來研究DMCs移植對小鼠慢性肝損傷修復(fù)的作用。而后，我們采用8Gy致死劑量照射小鼠所致急性放射性肝損傷模型研究DMCs移植對小鼠急性肝損傷修復(fù)的作用。本課題的主要結(jié)果包括:
　　1.DMCs移植治療CCL4誘導(dǎo)的肝纖維化模型中DMCs通過旁分泌及營養(yǎng)支持、抑制TGF-β信號通路、抗炎及免疫調(diào)節(jié)等機(jī)制同時(shí)影響肝纖維化發(fā)生發(fā)展過程中的多個(gè)環(huán)節(jié)因素，顯著改

15、善了小鼠肝纖維化和促進(jìn)小鼠肝組織再生;
　　2.DMCs移植治療致死劑量照射小鼠所致急性肝損傷模型中，DMCs移植能夠促進(jìn)致死劑量照射小鼠的存活，且能夠選擇性長期定植于小鼠肝內(nèi)并促進(jìn)該急性放射性肝損傷的修復(fù)，并獲得了DIECs、DMCs和BMMψ三種細(xì)胞的差異基因表達(dá)譜，為后續(xù)進(jìn)一步研究打下基礎(chǔ);
　　3.DMCs移植治療兩種不同類型肝損傷，由于兩種肝損傷的受損組織區(qū)域微環(huán)境的不同，DMCs發(fā)揮治療效應(yīng)的機(jī)制有所不同，因此在