骨髓間充質(zhì)干細胞修復鼠肝損傷及體內(nèi)示蹤的實驗研究.pdf

1、研究背景：
　　 肝臟疾病是危及國民健康的最重要的疾病之一，各種原因引起的肝衰竭是終末期肝病死亡的最主要的原因。肝移植雖然可以挽救肝衰竭患者的生命，但是手術(shù)費用高，肝源缺乏，術(shù)后肝炎再復發(fā)，術(shù)后需長期使用免疫抑制藥和抗病毒藥物制約了臨床的廣泛應用，所以迫切需要尋找一種更有效、更安全、更經(jīng)濟的治療肝衰竭的治療方法。近年來，骨髓間充質(zhì)干細胞(Bone marrow-derivedmesenchymal stem cells，BMSC

2、s)移植在治療難治性心肌梗死、神經(jīng)系統(tǒng)損傷、骨及軟骨疾病等的研究取得很大的進展。國內(nèi)研究自體骨髓干細胞移植治療能改善肝衰竭患者的肝功能，提高生存率，但是缺乏客觀的評價標準。干細胞在肝損傷后肝細胞再生過程中起著重要作用，而BMSCs在特定環(huán)境下可分化成肝干細胞及肝細胞，參與肝臟功能的修復和器官重構(gòu)。但是，BMSCs注入體內(nèi)后，是否遷移至肝臟?是否分化為成熟肝細胞?干細胞修復肝臟的效果如何?由于缺乏有效的細胞示蹤方法和評價手段，目前尚不明確

3、。所以，通過體內(nèi)生物發(fā)光成像技術(shù)對移植干細胞進行動態(tài)示蹤，明確骨髓間充質(zhì)干細胞在體內(nèi)分布、增殖情況，及修復受損肝臟的效果，對開展干細胞治療肝衰竭的臨床研究具有重要的意義。
　　 研究目的：
　　 1.觀察骨髓間充質(zhì)干細胞對大鼠肝損傷的修復作用。
　　 2.了解BMSCs在肝損傷鼠體內(nèi)遷移、分布、定植情況。
　　 材料和方法：
　　 1.采用密度梯度離心法結(jié)合貼壁法分離BMSCs，體外傳代、純化、擴

4、增，流式細胞儀檢測其表面標志：CD11b/c、CD29、CD34、CD44、CD45、CD90。
　　 2.將BMSCs在含肝細胞生長因子(hepatocyte growth factor,HGF)、成纖維細胞生長因子(fibroblast growth factor,FGF)等細胞因子的培養(yǎng)液中培養(yǎng)，向肝細胞方向誘導分化。
　　 3.選取選取體重180-220g SD純系大鼠50只，其中30只以D-氨基半乳糖+脂多糖(

5、LPS)建立急性肝損傷動物模型。動物實驗分組如下：1組(正常對照組)：正常SD鼠(10只)；2組(正常移植BMSCs組)：正常SD鼠，移植BMSCs(10只)；3組(肝損傷對照組)：肝損傷SD鼠，不行BMSCs移植(15只)；4組(肝損傷移植BMSCs組)：肝損傷SD鼠，移植BMSCs(15只)。
　　 4.構(gòu)建含GFP及Luc雙報告基因的慢病毒載體(plig)，感染BMSCs及擴增。
　　 5.建立C57BL/6小鼠肝

6、損傷模型，移植plig標記的BMSCs，應用體內(nèi)生物發(fā)光成像技術(shù)(in vivo bioluminescence imaging，BLI)，示蹤BMSCs在肝損傷小鼠體內(nèi)的定植情況。
　　 6.建立BALB/c裸鼠肝損傷模型，移植plig標記的BMSCs，應用體內(nèi)生物發(fā)光成像技術(shù)，示蹤BMSCs在肝損傷小鼠體內(nèi)的定植情況。
　　 結(jié)果：
　　 1.經(jīng)過分離培養(yǎng)的SD大鼠BMSCs高表達CD29、CD44、CD90

7、，低表達CD11b/c、CD34、CD45；BMSCs在含有HGF、FGF等細胞因子的培養(yǎng)液中誘導分化，第7d即有CK18、ALB的表達；第14d開始有AFP的表達。
　　 2.肝損傷移植BMSCs組在第4周時其血清白蛋白(ALB)水平明顯高于肝損傷對照組(P＜0.001)，但與正常對照組及正常BMSCs移植組比較，ALB的水平無統(tǒng)計學差異；肝損傷對照組第4周時血清ALB水平明顯低于基線，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.001)。正常

8、對照組、正常移植BMSCs組、肝損傷對照組、肝損傷移植BMSCs組在移植基線及BMSCs移植后2周及4周AST、ALT水平無統(tǒng)計學差異；
　　 3.肝損傷移植BMSCs組在第4周時肝臟組織學明顯好于肝損傷對照組，與正常對照組及正常移植BMSCs相比無明顯差異。
　　 4.BLI示蹤顯示：plig標記的BMSCs在經(jīng)門靜脈移植入裸鼠體內(nèi)后可見肝臟部位明顯的生物發(fā)光現(xiàn)象，顯示BMSCs可在肝臟定植，但隨著時間變化出現(xiàn)發(fā)光強度

9、的衰減；而移植入正常小鼠體內(nèi)的BMSCs未發(fā)現(xiàn)明顯的生物發(fā)光現(xiàn)象；
　　 結(jié)論：
　　 1.經(jīng)過分離、純化的BMSCs具備在體外大量增殖的潛能，可以作為組織工程進行組織修復的種子細胞。
　　 2.BMSCs在一定條件下可以分化為肝(樣)細胞。
　　 3.BMSCs移植可以修復肝損傷，部分改善生化學指標和組織學指標。
　　 4.BLI顯示BMSCs可以在受損肝臟定植。
　　 5.BMSCs移