骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞腎臟移植及MR示蹤研究.pdf

1、第一部分、間充質(zhì)干細(xì)胞磁粒子標(biāo)記及經(jīng)腎動(dòng)脈移植MR成像的實(shí)驗(yàn)研究 目的：分離純化大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)，鑒定其多向分化特性，應(yīng)用磁性氧化鐵納米粒子和多聚賴氨酸(Poly-L-Lysine，PLL)的偶聯(lián)物Fe2O3-PLL體外標(biāo)記MSCs，MR活體示蹤經(jīng)腎動(dòng)脈移植入大鼠正常腎臟的標(biāo)記細(xì)胞。 方法：制備Fe2O3-PLL，分離大鼠骨髓MSCs進(jìn)行純化并傳代培養(yǎng)，流式細(xì)

2、胞術(shù)(FCM)檢測(cè)MSCs細(xì)胞表型，成骨和成脂肪誘導(dǎo)鑒定骨髓MSCs的多向分化特性。標(biāo)記Fe2O3-PLL，胎盼藍(lán)拒染法檢測(cè)細(xì)胞活率，觀察標(biāo)記前后細(xì)胞的生長(zhǎng)狀況，普魯士藍(lán)染色及透射電子顯微鏡顯示細(xì)胞內(nèi)鐵，原子吸收光譜儀進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)鐵定量。分別將標(biāo)記(9只)和未標(biāo)記細(xì)胞(3只)經(jīng)左腎動(dòng)脈移植入大鼠正常腎臟，移植后即刻，第1，3，5，8d應(yīng)用MRI對(duì)移植細(xì)胞進(jìn)行活體示蹤并與腎臟普魯士藍(lán)染色及CD68抗體染色對(duì)照，確認(rèn)移植MSCs。 結(jié)

3、果：獲得MSCs純度高，流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示MSCs細(xì)胞均一性好，達(dá)99％以上CD29<'+>、CD90<'+>、CD45<'->，具有干細(xì)胞特性，可以分化為脂肪和骨細(xì)胞。Fe<,2>O<,3>-PLL標(biāo)記率近100％，普魯士藍(lán)染色及電鏡顯示藍(lán)色鐵顆粒位于MSCs胞質(zhì)內(nèi)。原子吸收光譜儀測(cè)定細(xì)胞內(nèi)鐵含量為14.01±4.32pg，MSCs的Fe<,2>O<,3>-PLL標(biāo)記率近100％，標(biāo)記對(duì)細(xì)胞活率及生長(zhǎng)狀況無(wú)明顯影響。標(biāo)記細(xì)胞移植后大鼠

4、腎臟皮質(zhì)區(qū)信號(hào)強(qiáng)度明顯下降，T<,2>*WI信號(hào)改變最明顯，信號(hào)強(qiáng)度下降程度隨著時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸減輕，在移植后第8天已比較明顯。組織學(xué)分析見(jiàn)絕大多數(shù)標(biāo)記細(xì)胞分布于腎皮質(zhì)腎小球內(nèi)，與MRI信號(hào)基本一致。MR掃描序列中以T<,2>*WI的信號(hào)強(qiáng)度變化最大。未標(biāo)記細(xì)胞移植后未見(jiàn)腎臟信號(hào)改變。 結(jié)論：獲得骨髓MSCs純度高，具有干細(xì)胞特性；Fe<,2>O<,3>-PLL可以對(duì)其進(jìn)行安全有效的標(biāo)記；經(jīng)腎動(dòng)脈移植入正常大鼠腎臟的MSCs彌漫分

5、布于腎小球內(nèi)，臨床應(yīng)用型1.5T磁共振儀可對(duì)移植的標(biāo)記細(xì)胞進(jìn)行活體示蹤。 第二部分、間充質(zhì)干細(xì)胞急性腎功能衰竭大鼠腎動(dòng)脈移植MR活體示蹤研究 目的：建立急性腎功能衰竭(acute renal failure，ARF)模型，應(yīng)用Fe<,2>O<,3>-PLL標(biāo)記大鼠骨髓MSCs，MR活體示蹤經(jīng)腎動(dòng)脈移植入ARF大鼠體內(nèi)的標(biāo)記細(xì)胞，觀察其分布，為經(jīng)動(dòng)脈移植MSCs治療ARF提供基礎(chǔ)。 方法：Fe<,2>O<,3>-P

6、LL標(biāo)記大鼠骨髓MSCs細(xì)胞，普魯士藍(lán)染色顯示細(xì)胞內(nèi)鐵。采用后肢肌肉注射甘油建立ARF大鼠模型，將模型大鼠分為2組，分別經(jīng)左。腎動(dòng)脈移植入標(biāo)記細(xì)胞(6只)和未標(biāo)記細(xì)胞(5只)，移植后即刻及第1、3、5、8天應(yīng)用MR的T<,2>*WI對(duì)腎臟進(jìn)行活體成像，測(cè)量腎臟皮質(zhì)信噪比(signal-to-noise ratio，SNR)的變化，對(duì)移植細(xì)胞進(jìn)行活體示蹤，并與腎臟組織切片普魯士藍(lán)染色和HE染色對(duì)照。 結(jié)果：MSCs的Fe<,2>O

7、<,3>-PLL標(biāo)記率近100％，普魯士藍(lán)染色顯示藍(lán)色鐵顆粒位于MSCs胞質(zhì)內(nèi)。標(biāo)記細(xì)胞移植后ARF大鼠腎臟皮質(zhì)區(qū)信號(hào)強(qiáng)度明顯下降，以T<,2>*WI信號(hào)改變最明顯，一直持續(xù)到移植后第8天。與注射前比較，標(biāo)記細(xì)胞移植后即刻及1、3、5、8d腎臟皮質(zhì)SNR差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(ANOVA，F(xiàn)=75.458，P<0.05；LSD test，P<0.05；t值分別為7.52，7.34，7.29，6.84，5.01，P<0.05)。未標(biāo)記細(xì)胞移植

8、后各時(shí)間點(diǎn)與移植前比較，SNR改變差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(ANOVA，F(xiàn)=0.609，P>0.05)。組織學(xué)分析見(jiàn)絕大多數(shù)標(biāo)記細(xì)胞分布于腎皮質(zhì)腎小球內(nèi)，與MRI信號(hào)改變區(qū)域基本一致。 結(jié)論：經(jīng)腎動(dòng)脈移植入ARF大鼠腎臟的MSCs經(jīng)臨床應(yīng)用型1.5 T磁共振儀活體示蹤顯示其在早期彌漫分布于ARF腎臟腎小球內(nèi)，具有和同樣途徑移植入正常腎臟中的MSCs相似的分布特點(diǎn)。 第三部分、MR 活體監(jiān)測(cè)間充質(zhì)干細(xì)胞腹主動(dòng)脈移植治療急性腎功能衰

9、竭研究 目的：Fe<,2>O<,3>-PLL體外標(biāo)記骨髓：MSCs，MR活體監(jiān)測(cè)同種異體移植入ARF大鼠腹主動(dòng)脈的標(biāo)記細(xì)胞并檢測(cè)大鼠腎功能及腎臟病理改變，探討其腹主動(dòng)脈移植后治療ARF的體內(nèi)分布及可能機(jī)制。 方法：磁性納米粒子體外標(biāo)記大鼠骨髓MSCs。ARF大鼠分為3組，插導(dǎo)管至腹主動(dòng)脈，分別移植入標(biāo)記細(xì)胞(A組，10只)；移植入未標(biāo)記細(xì)胞(B組，10只)；灌注等量生理鹽水(C組，10只)。移植后1小時(shí)及第1、2、4天應(yīng)

10、用MR的T<,2>*WI對(duì)大鼠腎臟進(jìn)行成像，測(cè)量腎臟信噪比(SNR)的變化，對(duì)移植細(xì)胞進(jìn)行活體示蹤，并與腎臟普魯士藍(lán)染色對(duì)照，確認(rèn)移植MSCs。各個(gè)時(shí)間點(diǎn)監(jiān)測(cè)大鼠腎功能指標(biāo)包括：血清尿素氮(BUN)和肌酐(SCr)；監(jiān)測(cè)腎臟病理變化情況，包括HE、過(guò)碘酸雪夫反應(yīng)染色(periodic acildShiff,PAS)、免疫組織化學(xué)(包括Bcl-2、PCNA抗體)染色，監(jiān)測(cè)并比較腎臟損傷程度及腎小管細(xì)胞凋亡及增殖情況；電鏡觀察腎小管超微結(jié)構(gòu)

11、改變。 結(jié)果：A組標(biāo)記細(xì)胞移植后1 h MR掃描示腎臟皮質(zhì)外帶信號(hào)即有明顯下降，可見(jiàn)點(diǎn)狀低信號(hào)帶，信號(hào)改變持續(xù)至細(xì)胞移植后4d，與注射前比較，A組移植后1h及1、2、4 d腎臟皮質(zhì)外帶SNR差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(ANOVA，F(xiàn)=125.6，P<0.05；LSD test，P<0.05：t值分別為7.64，7.50，7.69，7.43，P<0.05)，明顯下降。B組未標(biāo)記細(xì)胞移植后各時(shí)間點(diǎn)與移植前比較，SNR改變差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(A

12、NOVA，F(xiàn)=0.413，P>0.05)。組織學(xué)分析見(jiàn)標(biāo)記細(xì)胞分布于腎皮質(zhì)腎小球內(nèi)，與MR信號(hào)改變一致。細(xì)胞移植組腎功能優(yōu)于對(duì)照組C，腎損傷程度及凋亡比對(duì)照組明顯減輕，腎小管上皮增殖增加；電鏡觀察示腎小管超微結(jié)構(gòu)損傷細(xì)胞移植組亦輕于對(duì)照組。A、B組之間各項(xiàng)腎損傷指標(biāo)均無(wú)顯著差異。 結(jié)論：臨床應(yīng)用型1.5 T磁共振儀可活體監(jiān)測(cè)顯示移植入ARF大鼠腹主動(dòng)脈的MSCs，移機(jī)后早期細(xì)胞分布于腎皮質(zhì)腎小球內(nèi)；MSCs移植后早期可促進(jìn)ARF

13、恢復(fù)，可能通過(guò)除橫向分化以外的途徑發(fā)揮ARF的治療作用。 第四部分、間充質(zhì)干細(xì)胞急性腎功能衰竭大鼠體內(nèi)分布的示蹤研究 目的：觀察磁粒子標(biāo)記后綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)轉(zhuǎn)基因小鼠骨髓MSCs靜脈移植后在ARF大鼠體內(nèi)分布情況，MR對(duì)其進(jìn)行活體示蹤，探討其改善ARF動(dòng)物模型腎損害的可行性及可能機(jī)理。 方法：Fe<,2>O<,3>-PLL體外標(biāo)記GFP轉(zhuǎn)基因小鼠骨髓MSC

14、s。36只SD大鼠，30只制作ARF模型，分成A、B、C 3組，A組(n=10)為尾靜脈注射磁粒子標(biāo)記的GFP陽(yáng)性MSCs，B組(n=10)為尾靜脈注射GFP陽(yáng)性MSCs，C組(n=10)尾靜脈注射等量生理鹽水。另外D組(n=6)未做腎衰模型，為正常對(duì)照組，不做任何干預(yù)。各組細(xì)胞移植前，移植后1天、3天各個(gè)時(shí)間點(diǎn)取3只進(jìn)行MR掃描并處死，剩余大鼠及D組大鼠于移植后10天行MR掃描后全部處死。所有大鼠處死前抽血檢測(cè)腎功能指標(biāo)。處死后行組織

15、學(xué)檢查包括普魯士藍(lán)染色與綠色熒光對(duì)照觀察，確認(rèn)移植MSCs；HE、PAS染色監(jiān)測(cè)并比較腎臟損傷程度。 結(jié)果：A組標(biāo)記細(xì)胞移植前后各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的MR掃描。腎臟信號(hào)SNR，與B、C組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。A組標(biāo)記細(xì)胞移植后1天MR掃描示肝臟信號(hào)即有明顯下降，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，信號(hào)降低的程度下降，與注射前比較，A組移植后1、3、10天肝臟的SNR差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，10天時(shí)SNR仍較低，與B組比較差異仍有統(tǒng)計(jì)

16、學(xué)意義(P<0.05)。A、B組早期GFP陽(yáng)性細(xì)胞主要分布于肝竇內(nèi)，A組綠色熒光細(xì)胞與普魯士藍(lán)染色陽(yáng)性細(xì)胞對(duì)應(yīng)，與MR一致。A、B組早期即可見(jiàn)MSCs細(xì)胞分布于腎小管上皮，但腎臟MR信號(hào)無(wú)明確改變。細(xì)胞移植組腎功能優(yōu)于對(duì)照組C，腎損傷程度比對(duì)照組明顯減輕。 結(jié)論：磁粒子標(biāo)記法對(duì)骨髓MSCs的ARF治療作用無(wú)明顯影響。急性腎功能衰竭狀態(tài)下早期經(jīng)靜脈移植后MSCs較多分布于肝臟，少量MSCs在稍晚時(shí)期可以遷移到腎小管區(qū)，但臨床型MR