骨髓基質干細胞對大鼠外科肝損傷的修復與體內示蹤的研究.pdf

1、據(jù)統(tǒng)計,肝臟損傷約占腹部外傷的15％～20%,嚴重威脅著人類的健康甚至生命。隨著交通運輸業(yè)的飛速發(fā)展及車輛的頻繁增加導致的肝臟外傷和肝臟原有的基礎疾病等導致肝臟部分切除或大部切除的發(fā)生率在日益升高,因此,大鼠外科肝損傷模型的建立對臨床和科學研究的作用也顯得越來越突出。經典的部分肝切除模型是1931年Higgins和Anderson首先報道的,這項研究將大鼠肝臟的中葉和左葉切除,約占總體積的70%,由于手術方法的簡便快捷而被廣泛學習采用。

2、之后雖有很多學者報道對大鼠做部分肝切除手術,但由于出于不同的實驗目的,尚未對手術組和正常對照組大鼠的生存狀態(tài)、肝功能情況及肝臟病理作系統(tǒng)的統(tǒng)計學比較。除此之外,也尚未見系統(tǒng)建立大鼠外科肝損傷模型的報道。
　　 原位肝移植(Orthotopic liver transplantation,OLT)是目前治療各種終末期肝臟疾病的有效方法,但隨著這種治療方法弊端的日益暴露,如肝臟供體短缺、免疫排斥、移植物抗宿主病等,使得OLT在臨床上

3、的研究進展受到了限制。隨著干細胞研究和應用領域的深入,細胞移植治療肝臟損傷已成為人們的研究熱點。大量文獻報道表明,骨髓基質干細胞在體內外特定條件和微環(huán)境下可以轉化為肝細胞,并呈現(xiàn)肝細胞的功能,而且移植的細胞優(yōu)先定居于受損傷的器官,這為細胞移植治療外科肝損傷提供了細胞學基礎。文獻報道,骨髓基質干細胞經不同途徑同種異體移植入機體受損傷的肝臟,并且其對肝臟疾病具有很好的治療作用,但經不同途徑移植入機體后,細胞在肝臟內分布和定居效果的比較尚未見

4、文獻報道。
　　 研究表明菲立磁可作為磁共振成像技術(MRI)示蹤骨髓基質干細胞的有效標記物,且在一定的濃度下標記骨髓基質干細胞后不會改變細胞和接受該細胞的器官的生物化學功能,因此菲立磁在實驗研究和臨床治療方面被作為標記物而普遍采用。目前,利用菲立磁標記骨髓基質干細胞及MRI對其體外示蹤的方法經門靜脈和體表淺靜脈對大鼠行細胞移植的報道較多,未見肝內直接移植細胞及對其示蹤效果檢測的報道。以往細胞移植治療化學性肝損傷的報道較多,但尚

5、未見菲立磁標記骨髓基質干細胞治療外科肝損傷及對其在外科肝損傷大鼠肝臟內的分布和定居情況示蹤的報道。因此,我們首先建立大鼠外科肝損傷模型,擬利用菲立磁標記骨髓基質干細胞,通過不同途徑移植入大鼠肝臟內,用MRI對其進行體外追蹤,以期建立最佳移植方案,利用此方案將菲立磁標記的骨髓基質干細胞移植入外科肝損傷模型的大鼠肝臟內,并用MRI對其進行示蹤,進一步探索骨髓基質干細胞對外科肝損傷大鼠肝功能的恢復效果及其在損傷肝臟內的分布和定居情況。

6、　　 課題分以下三個部分
　　 一、大鼠外科肝損傷模型建立的研究
　　 目的:探討SD大鼠外科肝損傷動物模型的制作方法。
　　 方法:選用8周齡SD大鼠40只,隨機分成模型組和對照組,每組20只。模型組切除大鼠肝臟總體積的70%;對照組在相同的條件下打開關閉腹腔;分別在術前和術后12h、1d、3d、5d、7d、14d對兩組大鼠頸靜脈采血,取血漿1 ml檢測兩組大鼠的谷丙轉氨酶(ALT)、谷草轉氨酶(AST)、堿

7、性磷酸酶(ALP)、總膽紅素(TB)和直接膽紅素(DBIL)指標,術后14 d大體和光鏡下觀察兩組大鼠肝臟的病理變化。
　　 結果:①模型組肝功能指標AST、ALP和DBIL在術后12 h至7 d,與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05),ALT和TB在術后12 h至5 d與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05),至術后14 d兩組大鼠肝功能各項指標比較差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05):②術后14 d大體觀察大鼠肝臟:

8、對照組大鼠肝臟呈紅褐色,各葉很薄,分別以一小細蒂連接于肝門部,肝緣銳利。模型組大鼠殘余肝臟較對照組顏色加深,整個肝臟體積較前增大,表面有光澤,每個肝葉增厚,肥大,肝緣變鈍;鏡下觀察:對照組大鼠肝細胞之間排列疏松,細胞棱角較銳利,肝竇較寬。模型組大鼠肝細胞棱角變鈍、肥大、水腫、嗜酸性變,細胞與細胞之間堆積緊密。
　　 結論:切除肝臟總體積70%的大鼠可以正常存活,且肝功能各項指標和肝臟病理與對常組相比有顯著性差異,此方法可有效建立

9、大鼠外科肝損傷模型。
　　 二、不同途徑大鼠骨髓基質干細胞同種異體肝臟移植效果的比較
　　 目的:比較經不同移植途徑大鼠骨髓基質干細胞向同種異體大鼠肝臟移植的效果。
　　 方法:①大鼠骨髓基質干細胞的提取與檢測:選用5周齡SD大鼠,從大鼠股骨和脛骨的骨髓腔分離骨髓細胞,采用全骨髓細胞貼壁傳代培養(yǎng)方法培養(yǎng)獲取骨髓基質干細胞,觀察各代細胞的形態(tài)和細胞生長曲線;流式細胞技術檢測第3代細胞表面標志;②大鼠骨髓基質干細胞的

10、標記:用含菲立磁的全細胞培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)第3代骨髓基質干細胞12 h,普魯士藍染色、顯微鏡下計數(shù)含藍色顆粒的細胞,估計標記效率,電鏡掃描菲立磁的標記情況。③分組移植:選用8周齡SD大鼠30只,隨機分成3組(肝內移植組、門靜脈移植組、股靜脈移植組),每組10只,取濃度為1×106/ml菲立磁標記的骨髓基質干細胞1ml,分別經大鼠肝實質、門靜脈、股靜脈三種途徑移植到大鼠肝臟內,于移植后12 h、1d、3d、5d、7d、14d用MRI分別對三組

11、大鼠肝臟進行掃描,并于移植后第14 d普魯士藍染色并在光鏡下觀察大鼠肝臟組織切片,對含藍色顆粒的細胞進行計數(shù)。
　　 結果:①大鼠骨髓基質干細胞的提取與檢測結果:骨髓來源的骨髓基質干細胞呈長梭型,類似成纖維細胞,胞體折光性好,流式細胞儀檢測干細胞的表面標志CD29(99.7%)和CD44(99.4%)呈陽性,造血干細胞表面標志CD34(1.3%)和自細胞共同抗原CD45(2.2%)呈陰性。②大鼠骨髓基質干細胞的標記結果:光鏡下菲

12、立磁標記的骨髓基質干細胞普魯士藍染色顯示細胞核和胞漿紅染,大部分細胞的胞漿中含有被染成藍色的鐵顆粒,細胞計數(shù)法計算菲立磁的標記效率可達90%以上。電鏡下的骨髓基質干細胞的細胞膜有很多突起的絨毛,細胞質內有散在的囊泡樣包涵體結構,內含有高密度鐵顆粒,胞漿內各種細胞器活性未見明顯異常。③分組移植結果:將骨髓基質干細胞經不同途徑移植入大鼠肝臟內,肝內移植組所有大鼠在移植后各個時間點MRI均能檢測到肝臟細胞移植部位橢圓形低信號區(qū),低信號范圍隨著

13、時間的延長逐漸縮小,信號強度逐漸升高;門靜脈移植組所有大鼠在移植后各個時間點MRI均能檢測到肝門區(qū)門靜脈內分支狀低信號改變,信號強度低于肝內移植組,隨著時間的延長低信號分布形態(tài)無明顯變化,信號強度逐漸升高;股靜脈移植組肝臟的各層面在各個時間點均未檢測到明顯低信號改變。移植后14 d三組大鼠肝臟組織切片均可見含藍色顆粒的細胞,肝內移植組最多,門靜脈移植組次之,股靜脈移植組最少,差異有顯著統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　 結論:對

14、菲立磁標記的骨髓基質干細胞經肝內、門靜脈與股靜脈三種途徑同種異體移植的比較,肝內移植途徑效果最好。
　　 三、骨髓基質干細胞對大鼠外科肝損傷的修復與體內示蹤的研究
　　 目的:探討骨髓基質干細胞對大鼠外科肝損傷的修復作用及其在活體肝臟內分布和定居的示蹤情況。
　　 方法:選用8周齡SD大鼠40只,隨機分成移植組和對照組,每組20只。所有大鼠均按照第一部分的實驗方法建立大鼠外科肝損傷模型,移植組同時取菲立磁標記的濃

15、度為1×106/ml的骨髓基質干細胞1 ml,緩慢注射到大鼠肝右葉內;對照組在相同部位注射等量的生理鹽水。兩組大鼠分別于術后12h、1d、3d、5d、7d、14d通過右頸靜脈采血2.5 ml,離心,取血漿1 ml,分別檢測和比較兩組大鼠AST、ALT、ALP、TB和DBIL指標,并用MRI對兩組大鼠的肝臟進行掃描,于術后14 d普魯士藍染色兩組大鼠肝臟組織切片,光鏡觀察肝臟的病理變化。
　　 結果:移植組大鼠在術后12h、1d、

16、3d、5d、7d、14d MRI均能檢測到肝臟移植部位橢圓形低信號區(qū),低信號范圍隨時間的延長逐漸擴大,信號強度逐漸升高,而對照組大鼠在術后12h MRI可檢測到肝臟移植部位的高信號區(qū),此后肝內高信號區(qū)消失;移植組大鼠的ALT指標在移植后1d、3d、5d均顯著低于對照組(P＜0.05),AST、TB指標在移植后12h、1d、3d、5d均顯著低于對照組(P＜0.05),ALP、DBIL指標在移植后12h、1d、3d、5d、7d均顯著低于對照