成體內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞的MRI活體示蹤.pdf

1、研究背景:
　　 神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cells，NSCs)的應(yīng)用為中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)再生和功能重建提供了全新的治療思路。目前應(yīng)用NSCs修復(fù)中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷主要有移植外源性干細(xì)胞的“替代治療”策略和激活內(nèi)源性干細(xì)胞的“補(bǔ)充治療”策略兩種。內(nèi)源性NSCs因具有來源穩(wěn)定可靠、無倫理道德問題、無免疫排斥反應(yīng)等多種優(yōu)勢而成為當(dāng)前的研究熱點(diǎn)。MRI是目前理想的干細(xì)胞活體示蹤分子影像技術(shù)。但MRI示蹤技術(shù)目前主要用于外源性干

2、細(xì)胞的活體示蹤，對(duì)內(nèi)源性干細(xì)胞的示蹤鮮有報(bào)道。
　　 研究目的:
　　 探討利用靶向性磁納米微粒實(shí)現(xiàn)成體內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞MRI靶向示蹤的可行性及持久性。
　　 材料方法:
　　 1.成體NSCs的分離、培養(yǎng)及鑒定。
　　 健康成年C57BL/6J小鼠，取腦，吹打成單細(xì)胞懸液，用抗CD15免疫磁珠分選后，懸浮細(xì)胞培養(yǎng)法，對(duì)NSCs行Nestin、CD15鑒定及誘導(dǎo)分化后MAP 2、GFAP和O4鑒定

3、。
　　 2.靶向磁珠的弛豫特性及體外試驗(yàn)。
　　 抗CD15微型磁珠行掃描電鏡檢查，了解其大小、形狀等。原子吸收光譜法測定其平均鐵含量。MRI掃描測量其T2弛豫時(shí)間及弛豫率?？笴D15磁珠與NSCs孵育后，MRI掃描觀察細(xì)胞信號(hào)強(qiáng)度改變，原子吸收法測定細(xì)胞平均鐵含量，透射電鏡及普魯士藍(lán)染色觀察納米微粒在細(xì)胞中的分布。抗CD15磁珠與腦組織切片孵育后，加入相應(yīng)熒光二抗，熒光顯微鏡觀察了解納米微粒在腦內(nèi)的分布。
　　

4、 3.正常小鼠內(nèi)源性NSCs的MRI活體示蹤及病理檢查。
　　 29只正常成年C57BL/6J小鼠隨機(jī)分為三組：靶向組11只，非靶向組9只，單純抗體組9只。于立體定位儀引導(dǎo)下向側(cè)腦室內(nèi)分別注射抗CD15磁珠、單純磁珠及單純抗體，于注射后1d、3d、7d、10d進(jìn)行系列小鼠腦部MRI檢查，觀察各組小鼠腦信號(hào)強(qiáng)度改變，并利用正常腦實(shí)質(zhì)信號(hào)強(qiáng)度對(duì)低信號(hào)改變區(qū)域的T2*信號(hào)強(qiáng)度進(jìn)行校正，比較各組各時(shí)間點(diǎn)上的校正T2*信號(hào)強(qiáng)度的差異。<

5、br>　　 腦室注射后各時(shí)間點(diǎn)上各組隨機(jī)選取一只小鼠，MRI掃描后取腦，制成石蠟切片，分別進(jìn)行CD15、Nestin雙標(biāo)記的免疫熒光檢查，并進(jìn)行普魯士藍(lán)染色，與MRI所觀察到的改變進(jìn)行比對(duì)，了解MRI靶向示蹤的可靠性。
　　 4.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　 計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((x)±s)表示。體外實(shí)驗(yàn)的靶向組、對(duì)照組細(xì)胞T2弛豫時(shí)間之間的比較使用單因素方差分析進(jìn)行檢驗(yàn)?；铙w實(shí)驗(yàn)各組圖像上各時(shí)間點(diǎn)的校正T2*信號(hào)強(qiáng)度之間的

6、比較采用重復(fù)測量資料的方差分析比較。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析使用SPSS 16.0軟件，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為P＜0.05。
　　 結(jié)果:
　　 1.成體NSCs的分離、培養(yǎng)及鑒定。
　　 抗CD15磁珠分選后的細(xì)胞懸浮生長，呈神經(jīng)球形態(tài)，免疫熒光鑒定Nestin及CD15陽性，分化后GFAP、MAP 2及O4陽性。
　　 2.靶向磁珠的弛豫特性及體外試驗(yàn)。
　　 抗CD15磁珠粒徑平均約73.77±10.11nm左右，鐵

7、含量為10.58μmol/ml，T2弛豫率為0.43×106mol-1·s-1。
　　 NSCs與靶向磁珠孵育后，與對(duì)照組細(xì)胞相比，其在T2WI及T2*WI上信號(hào)明顯降低，T2時(shí)間縮短。靶向組的T2值與對(duì)照組間均有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.001)。原子吸收光譜檢測示平均每個(gè)細(xì)胞的鐵含量為19.279pg；電鏡示細(xì)胞膜上可見致密的高電子密度的顆粒附著；普魯士藍(lán)染色見細(xì)胞膜藍(lán)染。
　　 熒光顯微鏡下觀察靶向組側(cè)腦室室管膜下區(qū)

8、及側(cè)腦室前方可見CD15陽性細(xì)胞。
　　 3.正常成年小鼠內(nèi)源性NSCs的MRI活體示蹤。
　　 正常成年小鼠側(cè)腦室內(nèi)注射抗CD15磁珠后1d，在T2*WI上可見同側(cè)吻側(cè)遷移流(rostral migratory stream，RMS)出現(xiàn)明顯低信號(hào)，注射后3d，RMS信號(hào)仍減低，但信號(hào)強(qiáng)度較前稍恢復(fù)，注射后7d，RMS的低信號(hào)改變進(jìn)一步恢復(fù)，注射后10d，RMS信號(hào)已接近正常。非靶向組及單純抗體組RMS于腦室注射前后均

9、未見類似低信號(hào)改變。
　　 注射后1d、3d、7d、10d，靶向組與非靶向組、單純抗體組間RMST2*校正信號(hào)強(qiáng)度的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均＜0.01)，靶向組注射后1d、3d、7d、10d與示蹤前的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均＜0.05)。非靶向組與單純抗體組間各時(shí)間點(diǎn)上均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.172～1.000)，兩組各時(shí)間點(diǎn)間的差異亦均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.112～1.000)。
　　 4.活體示蹤后的病理檢查。<