局灶性腦缺血后內(nèi)源性神經(jīng)干細胞增殖分化的機制及bFGF的干預.pdf

1、目的： 缺血性腦血管病是嚴重威脅人類健康的常見病和多發(fā)病，其病理過程涉及復雜的時間和空間級聯(lián)反應，雖然對其機制的了解越來越深入，但有效的治療手段仍然缺乏。堿性成纖維細胞生長因子(Basic fibroblast growth factor，bFGF)是一種有效的神經(jīng)營養(yǎng)因子和血管活性多肽。具有多種生物學活性，能促進神經(jīng)元的存活及突起生長，是神經(jīng)膠質(zhì)細胞、毛細血管內(nèi)皮細胞的促分裂原，并能拮抗興奮性氨基酸等多種有害物質(zhì)對神經(jīng)元的毒性

2、作用而保護神經(jīng)元．近年研究提示成年哺乳動物腦內(nèi)存在神經(jīng)干細胞(neural stem cell，NSC)，其主要位于側(cè)腦室下區(qū)和海馬齒狀回顆粒下區(qū)。這是神經(jīng)科學領域的重大發(fā)現(xiàn)，為目前一些棘手的神經(jīng)系統(tǒng)疾病如神經(jīng)變性病、遺傳病及嚴重的腦血管病的治療帶來希望。因為其具有終身自我更新能力及多分化潛能，在治療神經(jīng)系統(tǒng)多種疾病中擁有巨大潛力，尤其在腦血管病的替代治療方面更具有優(yōu)越性，為神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療提供了新的思路。 神經(jīng)干細胞的增殖和

3、分化受到多種因素的調(diào)控。Wnt信號分子在胚胎發(fā)育中可指導細胞的命運，在多種成體組織如肌肉、造血系統(tǒng)中也被證實具有促進原始細胞增殖的作用。為了揭示神經(jīng)干細胞的調(diào)控機制，闡明其如何保持自我更新，本研究選用局灶性腦缺血再灌注模型，觀察腦缺血再灌注后皮質(zhì)及海馬形態(tài)學的改變及bFGF的保護作用，采用BrdU標記分裂細胞觀察海馬神經(jīng)發(fā)生的時間規(guī)律。檢測腦缺血激活內(nèi)源性神經(jīng)干細胞過程中Wnt/β—catenin信號分子的變化，初步探索Wnt信號途徑與

4、神經(jīng)干細胞增殖分化的關系以及bFGF干擾作用。 材料和方法： 1、局灶性腦缺血再灌注模型的制備：健康雄性wistar大鼠，質(zhì)量250-300g。隨機分為3組：假手術組(sham組)，缺血再灌注組(I/R組)，bFGF組。用線栓法建立大腦中動脈閉塞(middle cerebral arteryoc clusion，MCAO)模型。sham組除不插線外，余同手術組，術后觀察右側(cè)Horner's征和左側(cè)肢體癱瘓體征以判斷模型是

5、否成功。 2、HE染色及電鏡觀察局灶性腦缺血再灌注后皮質(zhì)及海馬神經(jīng)元的形態(tài)學改變。 3、免疫組織化學檢測局灶性腦缺血再灌注后皮質(zhì)及海馬c—Myc蛋白的表達，TUNEL法檢測神經(jīng)元的凋亡及bFGF的干預。 4、BrdU標記及免疫組織化學檢測局灶性腦缺血再灌注后海馬神經(jīng)干細胞不同時間點的增殖規(guī)律及bFGF的干預。 5、利用Western Blot、RT-PCR檢測局灶性腦缺血再灌注后海馬Wnt—1、β—cat

6、enin蛋白和基因表達情況。 6、免疫組織化學、原位雜交檢測局灶性腦缺血再灌注后皮質(zhì)及海馬神經(jīng)元β—catenin蛋白和基因表達的情況及bFGF的干預。 實驗結(jié)果： 1、HE染色結(jié)果：光鏡下I/R組可見大量神經(jīng)元變性壞死，呈現(xiàn)胞體皺縮，變形，核固縮，胞漿濃縮呈深伊紅染色，間質(zhì)水腫明顯。bFGF組多數(shù)神經(jīng)元結(jié)構較完整，形態(tài)相對正常，間質(zhì)水腫輕。 2、電鏡觀察結(jié)果：sham組大鼠海馬神經(jīng)元核比較大、呈圓形或橢

7、圓形，核膜清晰、完整，胞質(zhì)內(nèi)細胞器豐富，結(jié)構清晰。I/R組可見核染色較深，核仁增大且致密，胞質(zhì)水腫，線粒體腫脹、嵴斷裂，基質(zhì)電子密度增高，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脫顆粒；軸突內(nèi)線粒體空泡樣變，髓鞘分層、散亂。bFGF組核質(zhì)電子密度較低，常染色質(zhì)多，呈細顆粒狀，分布較均勻，核仁呈網(wǎng)狀，線粒體呈橢圓形或桿狀，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)散在分布。 3、TUNEL法原位神經(jīng)元凋亡檢測結(jié)果：各組神經(jīng)元細胞核中有棕黃色顆粒者為陽性細胞，即凋亡細胞。sham組偶見凋亡細胞

8、，I/R組皮質(zhì)及海馬可見較多凋亡細胞，隨著bFGF的應用細胞凋亡數(shù)下降。 4、c—Myc免疫組織化學檢測：sham組，皮質(zhì)及海馬神經(jīng)元內(nèi)少見c—Myc免疫反應陽性細胞；I/R組，缺血再灌注損傷后皮質(zhì)及海馬神經(jīng)元內(nèi)c—Myc陽性表達明顯高于假手術組，在神經(jīng)元胞核內(nèi)可見大量棕黃色顆粒，其中部分細胞胞質(zhì)和胞核均可見陽性反應物。bFGF組，皮質(zhì)及海馬神經(jīng)元內(nèi)c—Myc表達較I/R組明顯減少。 5、BrdU免疫組織化學檢測：sha

9、m組海馬僅見少量散在的BrdU陽性細胞。I/R組3d時，BrdU陽性細胞開始增多，大小不一，呈簇狀分布，主要分布于SGZ：7d達峰值，除SGZ外門區(qū)可見散在的BrdU陽性細胞；21d開始減少，但在顆粒細胞層可見BrdU陽性細胞；與sham組比較，7、14和21d BrdU陽性細胞均明顯增多。bFGF組3d時BrdU陽性細胞開始增多，呈簇狀分布，隨著缺血時間延長BrdU陽性細胞明顯增加，7d達峰值21d數(shù)量仍處于高水平，門區(qū)可見較多散在的

10、BrdU陽性細胞，在顆粒細胞層BrdU陽性細胞增多：與I/R組比較，7、14和21dBrdU陽性細胞均顯著增加。 6、Western Blot、RT-PCR檢測NSC增殖分化相關蛋白基因變化：Western blot檢測結(jié)果顯示：sham組大鼠海馬無Wnt1的表達，β—catenin輕度表達，腦缺血再灌注3d可檢測到Wnt1、β—catenin開始增加，Wnt1表達在7d時達到高峰，β—catenin在14d時達高峰。21d后W

11、nt1、β—catenin表達減少。蛋白印跡分析結(jié)果與RT-PCR結(jié)果顯示一致。 7、β—catenin免疫組織化學及原位雜交檢測：sham組皮質(zhì)及海馬僅見少量陽性細胞。I/R組14d時，與sham組比較，皮質(zhì)及海馬神經(jīng)元β—catenin蛋白基因表達增多。bFGF組皮質(zhì)及海馬神經(jīng)元β—catenin蛋白基因表達較I/R組明顯增加。 結(jié)論： 1、bFGF減少缺血神經(jīng)元凋亡，對局灶性腦缺血皮質(zhì)及海馬神經(jīng)元具有保護作