綠色熒光蛋白體外轉(zhuǎn)染體內(nèi)示蹤異體骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的研究.pdf

1、目的：觀察經(jīng)質(zhì)粒為載體，脂質(zhì)體介導(dǎo)的綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)轉(zhuǎn)染的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外表達(dá)及體內(nèi)示蹤情況，觀察兩組骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞肌肉內(nèi)植入的存活和炎性反應(yīng)等情況，為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的異體移植提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法：以質(zhì)粒病毒為載體，PT67細(xì)胞為包裝細(xì)胞，介導(dǎo)綠色熒光蛋白轉(zhuǎn)染新西蘭大白兔的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞，在相差顯微鏡和熒光顯微鏡下觀察，流式細(xì)胞儀檢測(cè)GFP的表達(dá)效率，G418培養(yǎng)

2、液篩選轉(zhuǎn)染細(xì)胞，常規(guī)培養(yǎng)。在體外培養(yǎng)的第二代骨髓基質(zhì)干細(xì)胞中加入含BMP-2的誘導(dǎo)培養(yǎng)基分別在培養(yǎng)2周后，與未轉(zhuǎn)染的同期成骨細(xì)胞對(duì)照，在相差顯微鏡和熒光顯微鏡下觀察，流式細(xì)胞儀檢測(cè)GFP的表達(dá)效率，對(duì)比轉(zhuǎn)染組與對(duì)照組細(xì)胞細(xì)胞含量及生長(zhǎng)曲線情況，并將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞分別植人新西蘭大白兔和日本大耳白兔背部肌肉內(nèi)，在第3d、1w、3w、5w作活檢，利用激光共聚焦顯微鏡、透射電鏡及光學(xué)顯微鏡觀察異體BMSCs存活情況及周圍炎性細(xì)胞浸潤(rùn)等組織學(xué)變化。

3、 結(jié)果：1、骨髓基質(zhì)干細(xì)胞體外培養(yǎng)后貼壁、集落生長(zhǎng)，細(xì)胞呈梭形、多角形，有多個(gè)大小不一的突起，胞漿淡藍(lán)色，含有較大的顆粒，核卵圓形，細(xì)胞分裂相多見(jiàn)，連續(xù)傳代培養(yǎng)生長(zhǎng)良好。細(xì)胞生長(zhǎng)曲線示細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好。培養(yǎng)2周后骨髓基質(zhì)干細(xì)胞表面CD44抗原表達(dá)陽(yáng)性。2、BM-SCs經(jīng)質(zhì)粒病毒感染后，植入宿主后24時(shí)，冰凍切片后熒光顯微鏡下即可檢測(cè)到有綠色熒光表達(dá)，72h表達(dá)最強(qiáng)，隨著時(shí)間推移綠色熒光蛋白陽(yáng)性細(xì)胞均逐漸減少，到5周時(shí)仍可見(jiàn)少量表

4、達(dá)。3、術(shù)后自體組、異體組移植組動(dòng)物切口均未出現(xiàn)明顯的紅腫及分泌物，無(wú)異常死亡。初期HE染色可見(jiàn)自體、異體組細(xì)胞炎性反應(yīng)均明顯，有較多炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，以白細(xì)胞為主，隨時(shí)間推移植入?yún)^(qū)炎性反應(yīng)不明顯。 結(jié)論：1、異體骨髓基質(zhì)干細(xì)胞容易獲取、來(lái)源充足、可以大量擴(kuò)增，加入誘導(dǎo)液后細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變并向成骨細(xì)胞分化，可作為骨組織工程的種子細(xì)胞。2、GFP基因的導(dǎo)人不會(huì)影響骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的活性和生物學(xué)特性，可應(yīng)用于活體細(xì)胞的實(shí)時(shí)檢測(cè)。3、BM