山羊皮膚干細胞及綠色熒光蛋白基因轉(zhuǎn)染研究.pdf

1、表皮干細胞在創(chuàng)傷愈合過程中扮演著重要角色，目前利用表皮干細胞進行組織重建和轉(zhuǎn)基因研究成為生物醫(yī)學領域的重要方向。綠色熒光蛋白(GFP)是細胞生物學研究中應用最廣泛的標記性蛋白質(zhì)之一，不用加外源底物就能在活細胞中直接觀察基因是否表達。本試驗從山羊皮膚干細胞分離培養(yǎng)、生物學性特性鑒定、可塑性及GFP基因轉(zhuǎn)染四個方面進行研究，為皮膚干細胞的臨床應用提供基礎資料。 1.山羊皮膚干細胞的分離培養(yǎng) 組織塊培養(yǎng)法：浸洗、抗菌處理后，將

2、皮膚切成0.1cm×0.1cm左右的小塊，表皮面朝上貼于鋪有0.1％明膠的培養(yǎng)皿中，加少量培養(yǎng)液浸潤，2h后用HDMEM/F12(3∶1)+20％血清+5μg/mL胰島素+0.5μg/mL氫化可的松+100單位雙抗培養(yǎng)液培養(yǎng)，3日換液一次。有細胞脫出后把血清體積分數(shù)換為10％進行培養(yǎng)。 DispaseⅡ酶消化法：浸洗、抗菌處理后將皮膚塊切割成0.5cm×1cm左右的條狀，在含4mg/mLDispaseⅡ酶的小瓶中4℃冷消化16h

3、。分離表皮與真皮，將表皮剪成糜狀，0.25％胰酶37℃消化5-7min后中和，過濾，離心，接種。用HDMEM/F12(3∶1)+10％血清+5μg/mL胰島素+0.5μg/mL氫化可的松+10ng/mLEGF+雙抗100μg/mL培養(yǎng)液培養(yǎng)。 胰酶消化法：浸洗、抗菌處理后將皮膚塊切割成0.5cm×1cm左右的條狀，用0.25％胰酶40C冷消化12h。分離表皮與真皮。將表皮剪成糜狀，過濾，接種。 組織塊培養(yǎng)法簡單易行，組織

4、塊可重復利用，但原代細胞脫出時間較長，平均8d，需15d以上才能傳代，原代傳代通常采用差別消化法。季節(jié)對細胞脫出時間、原代傳代時間、傳代數(shù)有顯著影響。春夏季細胞遷出時間(4.9±1.4d)和原代細胞傳代時間(10.3±2.5d)比秋冬季短(10±1.5d，20.3±1.7d)，傳代數(shù)(7.4±3.5代)比秋冬季多(4.5±1.5代)；DispaseⅡ酶消化法周期短，8d左右即可傳代，細胞平均傳代次數(shù)為6.5代。不同季節(jié)所得細胞無顯著差異

5、。但處理麻煩。用本法最高傳14代仍無明顯分化。胰酶消化法分離細胞數(shù)量遠活力很差，難以長期傳代，平均僅傳3.2代。與組織塊培養(yǎng)法、DispaseⅡ酶消化法在傳代數(shù)上均差異極顯著(p＜0.01)。 2.山羊皮膚干細胞的生物學特性 顯微鏡下觀察可見細胞胞體透亮、體積小、球形、致密，核質(zhì)比高，數(shù)日后呈鑲嵌多角形，鋪路石樣生長，存在典型克隆團，有時出現(xiàn)PGCs樣集落。 分離培養(yǎng)的細胞體外增殖能力強，增殖能力下降。目前已傳至

6、第14代。細胞貼壁能力對黏附底物依賴性強，有無底物細胞貼壁率差異顯著，細胞在不同底物上生長貼壁率差異不顯著。培養(yǎng)至第10d時，第3代細胞克隆形成率在30％以上.以接種50個細胞的克隆形成率最高，為36％。細胞表達皮膚干細胞標志α6整合素，β1整合素，角蛋白K19，P63轉(zhuǎn)錄因子，CD71轉(zhuǎn)鐵蛋白受體，證實分離的細胞為皮膚干細胞。同時表達胚胎干細胞標志OCT-4轉(zhuǎn)錄因子。成功地進行液氮冷凍保存并復蘇，第3代細胞解凍后細胞活力在80％以上。

7、 3.皮膚干細胞體外誘導分化 1.用1μmol/L、5μmol/L5-氮胞苷處理表皮干細胞24h后繼續(xù)用B液培養(yǎng)，10d后部分細胞可分化為心肌樣細胞，α-actin抗體染色檢測陽性。 2.表皮干細胞用1mmolβ-Me預誘導24h和5mmolβ-Me正式誘導4h后，分化出神經(jīng)細胞，表達NSE,NF-200等神經(jīng)細胞標志。 3.表皮干細胞在Vc、β-磷酸甘油和地塞米松誘導24小時后，出現(xiàn)大量針尖大小的圓形細

8、胞。18d后AKP染色陽性，茜素紅染色陽性。 4.皮膚干細胞的GFP基因轉(zhuǎn)染 1.100mg/LG418培養(yǎng)KSC，10d時細胞絕大部分死亡，篩選時增加一個濃度梯度用G418150mg/L濃度進行篩選。 2.轉(zhuǎn)染24h后熒光顯微鏡下顯示綠色熒光強陽性，72h時熒光強度最大。 3.DNA濃度為1.6μg/mL，LipofectamineTM2000為4μL時，轉(zhuǎn)染效率最高，達30％。 4.MTT測定