絨山羊皮膚干細胞定位、遷移及次級毛囊生長期差異表達基因文庫的構建與篩選.pdf

1、本論文旨在研究絨山羊皮膚干細胞的分布位置及遷移軌跡，構建生長期和休止期次級毛囊差異表達基因文庫，篩選與絨山羊次級毛囊生長相關的特異表達基因，從而揭示產(chǎn)絨動物不同類型的毛囊干細胞的行為特征、定位分布、相互關系，特別是尚未見報道的次級毛囊的干細胞生物學特性，為建立毛囊干細胞休眠、增殖、遷移、分化和決定等生命活動過程和機制的模式提供方法和理論依據(jù)。 選擇體態(tài)相近、健康的周歲絨山羊，分成兩組：標記BrdU的實驗組和未標記BrdU的對照組

2、。根據(jù)干細胞的慢周期特性，對絨山羊表皮細胞DNA進行BrdU標記，定期取背部皮樣，4％多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋切片，免疫組化檢測，結果前10周內(nèi)BrdU結果呈陽性。8周，BrdU標記細胞主要位于初級、次級毛囊的毛球部，毛干也有分布；8～10周，BrdU標記細胞僅位于初、次級毛囊的外根鞘；10周后無陽性信號分布。選擇BrdU標記8周和8～10周的絨山羊背部皮樣，分離酶Ⅱ4℃消化3小時，分離完整毛囊。分別用分段培養(yǎng)法和Ⅳ型膠原粘附法對毛囊

3、標記細胞（毛球部和毛囊中段）進行培養(yǎng)，能形成典型的干細胞克隆，且細胞直徑較小，核質(zhì)比較大，符合皮膚干細胞的形態(tài)學特征。用皮膚干細胞的標志分子P63對BrdU標記細胞進行免疫組化鑒定，發(fā)現(xiàn)BrdU標記滯留細胞呈陽性。以上結果證明BrdU標記滯留細胞即為皮膚干細胞，初步確定干細胞位于初級、次級毛囊的毛母質(zhì)和外根鞘，在表皮基底層也有分布。 為進一步闡明次級毛囊周期性重建過程中干細胞分化啟動—休眠的調(diào)控基因，以生長期和休止期次級毛囊為研

4、究對象，利用抑制性消減雜交技術，構建了具有高消減效率的生長和休止期次級毛囊的cDNA文庫。挑取20個陽性克隆，用NestedPCRPrimer1和2R進行PCR擴增，插入片段長度主要分布在250～1000bp之間。 隨機挑取正、反向兩個差異表達基因文庫中的單克隆各750個進行PCR擴增、測序，分別獲得309條和344條有效序列，平均長度分別為693bp和596bp。將其進行同源性分析，各獲得224個和300個nucleotide

5、數(shù)據(jù)庫中山羊及其他物種的已知存在序列同源。在EST數(shù)據(jù)庫中分別找到76個、38個相似EST序列，還有9個和6個無同源性序列。在GenBank數(shù)據(jù)庫共注冊非冗余ESTs126條，序列號為64970025～64970150。對已知功能基因的ESTs進行分類，正反庫中細胞分裂類各為15個和13個、細胞信號類為44個和49個、細胞結構蛋白30個和52個、細胞防御類13個和21個、代謝類24個和46個、基因/蛋白表達類33個和37個、未分類的65

6、個和82個。 在此基礎上，進行了兩次熒光交換的cDNA芯片雜交，以篩選差異表達基因。發(fā)現(xiàn)6個次級毛囊生長期的差異基因，其中上調(diào)基因3個，下調(diào)基因3個；10個次級毛囊休止期的差異基因，其中上調(diào)基因9個，下調(diào)基因1個。 總之，本研究首次用BrdU活體標記追蹤的方法證明絨山羊初級、次級毛囊及表皮中均存在皮膚干細胞：首次建立了用SSH方法分離絨山羊次級毛囊生長和休止期差異表達基因的方法，并結合熒光交換的cDNA芯片雜交來篩選。所