陜北白絨山羊皮膚毛囊發(fā)育早期的轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析及VDR基因的功能研究.pdf

1、絨山羊的毛囊有初級(jí)毛囊(PHF)和次級(jí)毛囊(SHF)之分，分別決定著羊毛與羊絨的發(fā)育和再生。研究表明，絨山羊的毛囊發(fā)端于胎兒時(shí)期，主要成熟于胎兒時(shí)期，完成于青年羊階段，在整個(gè)發(fā)生發(fā)育過程中具有明顯的階段性特征。絨山羊的毛囊發(fā)生與發(fā)育涉及眾多關(guān)鍵基因，目前的主要功能基因及其互作網(wǎng)絡(luò)尚未明確。第二代高通量測(cè)序技術(shù)，特別是RNA-seq技術(shù)的應(yīng)用為絨山羊毛囊發(fā)育的分子調(diào)控研究提供了可能，目前在內(nèi)蒙古白絨山羊等品種上的研究也取得了較大進(jìn)展。然而

2、，對(duì)陜北白絨山羊的毛囊發(fā)育，特別是關(guān)于毛囊發(fā)育早期的研究尚屬空白。本研究旨在研究陜北白絨山羊胎兒期和羔羊期皮膚組織形態(tài)發(fā)育規(guī)律研究的基礎(chǔ)上，重點(diǎn)對(duì)其胎兒期早期(E60)、中期120d(E120)和末期(NB)的皮膚毛囊進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究與分析，進(jìn)而篩選、鑒定影響胎兒期絨山羊毛囊發(fā)育的關(guān)鍵基因，為絨山羊毛囊周期性生長(zhǎng)調(diào)控奠定理論基礎(chǔ);另外，本試驗(yàn)，試圖在基于CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建基因缺陷型毛乳頭細(xì)胞(DP)模型的基礎(chǔ)上，比較研究絨山

3、羊毛囊關(guān)鍵調(diào)控基因，如維生素D受體基因（VDR）的功能，并試圖通過添加外源化合物，驗(yàn)證關(guān)鍵基因的調(diào)控作用，為絨山羊的遺傳改良，特別是基因編輯修飾提供技術(shù)和候選基因。取得的主要研究結(jié)果如下:
　　1.陜北白絨山羊胎兒期60胎齡(E60)、120胎齡(E120)和新生羔羊(NB)三個(gè)階段觀察分析其毛囊組織形態(tài)特征，發(fā)現(xiàn)E60時(shí)PHF的基板在頭頸和體側(cè)部已出現(xiàn)，且頭頸部的基板深度均顯著大于體側(cè)部;至E120時(shí)PHF的結(jié)構(gòu)完整且毛干已經(jīng)形

4、成，但是未長(zhǎng)出皮膚表面。SHF大量出現(xiàn)，一些SHF的完整結(jié)構(gòu)已經(jīng)形成，還有大部分SHF結(jié)構(gòu)不完整，發(fā)育不成熟;至NB時(shí)，PHF中的毛干已經(jīng)長(zhǎng)出皮膚表面，完全發(fā)育成熟。SHF的一部分此時(shí)結(jié)構(gòu)完整，發(fā)育成熟，可是尚有大量結(jié)構(gòu)不完整的SHF。
　　2.陜北白絨山羊0-160日齡公羔分八個(gè)階段(0，7，14，28，42，56，84，160 d)觀測(cè)毛囊組織形態(tài)特征，結(jié)果表明絨山羊的毛囊群多為三元型毛囊，即3個(gè)PHF，周圍有若干個(gè)SHF構(gòu)成

5、一個(gè)毛囊群;0-14 d，少部分SHF結(jié)構(gòu)完整，且羊絨已經(jīng)長(zhǎng)出體表，大多數(shù)SHF結(jié)構(gòu)還不完整;14-84 d期間，毛囊群中SHF數(shù)量快速增加，長(zhǎng)度變長(zhǎng)且不斷向真皮層延伸;84-160 d時(shí)絕大多數(shù)SHF的內(nèi)根鞘、外根鞘等結(jié)構(gòu)完整，羊絨完全長(zhǎng)出體表。少數(shù)SHF的結(jié)構(gòu)完整，羊絨還未長(zhǎng)出體表，表明尚未成熟。
　　3.絨山羊E60、E120和NB階段，采集9個(gè)胎兒皮膚毛囊樣品（每個(gè)時(shí)期3個(gè)），成功構(gòu)建了9個(gè)總RNA文庫(kù)。經(jīng)Illumina

6、 HiSeqTM2000測(cè)序，從每個(gè)文庫(kù)獲得的干凈reads2.06千萬以上。分析表明E120/E60、NB/E60、E120/NB分別有1024、1801、0個(gè)DEGs，E60、E120和NB階段總共出現(xiàn)了2059個(gè)DEGs。
　　4.采用趨勢(shì)分析方法，對(duì)上述2059個(gè)DEGs表達(dá)軌跡的聚類分析，這些DEGs聚集在8條表達(dá)軌跡上，其中1975個(gè)DEGs主要聚集在4條表達(dá)軌跡上，且可能與毛囊發(fā)育有關(guān)。進(jìn)一步的GO富集分析表明，上述

7、2059個(gè)DEGs顯著富集在細(xì)胞位置、分子功能和生物過程等類別(P＜0.05)，且生物過程中屬于單組織過程的有80.6％DEGs，單組織細(xì)胞過程的有69.3％DEGs、生物調(diào)節(jié)的有48.1％ DEGs。KEGG的分析表明55.5％的DEGs參與了218條信號(hào)通路，且主要是富集在癌癥通路和ECM-受體相互作用信號(hào)通路上。
　　5.采用差異基因表達(dá)軌跡分析方法與KEGG分析方法綜合分析，發(fā)現(xiàn)主要聚集在4條轉(zhuǎn)錄軌跡上的1975個(gè)DEGs

8、中有10個(gè)DEGs被注釋在ECM及其受體相互作用信號(hào)通路上，且其在E60時(shí)的基因表達(dá)量顯著高于E120和NB時(shí)(P＜0.05)，說明這10個(gè)DEGs與毛囊發(fā)生有關(guān)。有10個(gè)DEGs被注釋到癌癥通路上，且其他通路上存在7個(gè)很重要的轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)基因。這些DEGs在E120、NB時(shí)的基因表達(dá)量顯著高于E60時(shí)(P＜0.05)，表明這17個(gè)DEGs可能與毛囊發(fā)育和成熟有關(guān);同時(shí)發(fā)現(xiàn)，VDR基因明顯與發(fā)育過程、角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖分化有關(guān)，而且VD

9、R基因在E120和NB時(shí)的表達(dá)量極顯著上調(diào)(P＜0.001)。
　　6.首次克隆陜北白絨山羊VDR基因完整的CDS區(qū)序列?；诖?，采用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)對(duì)VDR基因在絨山羊胎兒期的表達(dá)情況進(jìn)行了研究，結(jié)果表明E60和E120時(shí)在9個(gè)絨山羊組織中VDR mRNA的表達(dá)差異較大，且以E120時(shí)的皮膚組織中VDR基因的表達(dá)量最高;免疫組化研究結(jié)果表明，在E120和NB時(shí)VDR蛋白在毛囊內(nèi)根鞘、外根鞘和毛球部高表達(dá)。
　　7.基于C

10、RISPR/Cas9技術(shù)成功構(gòu)建了VDR缺陷型毛乳頭(DP)細(xì)胞模型，與野生型DP細(xì)胞相比，純合突變細(xì)胞cell-4中VDR基因的轉(zhuǎn)錄水平顯著降低77％，VDR蛋白水平顯著降低69.5％(P＜0.05)。在此基礎(chǔ)上，通過比較VDR缺陷型DP細(xì)胞與野生型DP細(xì)胞的培養(yǎng)情況，缺失VDR基因CDS區(qū)之后，DP細(xì)胞增殖速度明顯降低(P＜0.05)，而且IGF-1、Noggin、Lef1和b-catenin等4個(gè)基因的mRNA表達(dá)水平顯著下調(diào)(P

11、＜0.05)，說明VDR基因的缺失可能會(huì)抑制Wnt、Bmp和IGF-1信號(hào)通路，進(jìn)而影響毛囊的發(fā)育;
　　8.野生型DP細(xì)胞中添加外源化合物，發(fā)現(xiàn)不同濃度的CM（姜黃素）和AA（花生四烯酸）可顯著促進(jìn)DP細(xì)胞的增殖(P＜0.05)，顯著提高VDR基因的mRNA和蛋白表達(dá);顯著提高IGF1、Noggin、b-catenin和Lef1基因的mRNA表達(dá)(P＜0.05);同時(shí)，在VDR基因缺陷型DP細(xì)胞上發(fā)現(xiàn)具有類似結(jié)果，可是，當(dāng)添加A