濟寧青山羊皮膚毛囊細胞系的建立和細胞因子的作用研究.pdf

1、以濟寧青山羊為動物模型，從皮膚毛囊體外培養(yǎng)和遺傳學角度闡明毛囊的生長發(fā)育規(guī)律、影響因素及其調控機制，不僅可為提高山羊絨品質的育種改良奠定基礎；還可為提高羊毛品質、數(shù)量和毛皮花紋品質乃至醫(yī)學領域的人類毛發(fā)研究等提供借鑒。毛囊體外培養(yǎng)技術的完善，皮膚成纖維細胞系和毛囊外根鞘細胞系的建立，可為研究毛囊生長與分化機制，尤其是白毛和黑毛纖維形成機制提供良好模型，也是研究相關細胞因子以及激素對毛囊發(fā)育、羊毛品質和黑色素形成與調控機理的基礎。本研究在

2、成功構建了濟寧青山羊皮膚毛囊體外培養(yǎng)技術平臺的基礎上，篩選了最佳培養(yǎng)方法和培養(yǎng)體系，可為進一步深入研究毛囊分化與發(fā)育的影響因素和所涉及到的一系列生理現(xiàn)象，如皮膚毛囊細胞分化、真皮和表皮細胞間的互作等研究奠定基礎。主要研究內容、方法和結果如下：
　　 一、山羊毛囊體外培養(yǎng)體系的優(yōu)化
　　 通過比較不同培養(yǎng)溫度（38.5℃、3712和31℃）、不同培養(yǎng)基（無血清的Williams E培養(yǎng)基、無血清DMEM培養(yǎng)基和添加10％F

3、BS的DMEM培養(yǎng)基）和培養(yǎng)液pn等，優(yōu)化了山羊皮膚和毛囊的體外培養(yǎng)體系，結果發(fā)現(xiàn)：在無血清Williams E培養(yǎng)基，31℃培養(yǎng)溫度、飽和濕度、95％空氣和5％CO2的條件下毛囊生長狀況最佳。
　　 二、細胞因子對毛囊體外培養(yǎng)的影響研究
　　 采用3因子3水平的正交試驗設計原理，比較研究了添加不同質量濃度的類胰島素生長因子（IGF-I）、血管內皮細胞生長因子（VEGF）、表皮生長因子（EGF）和催乳素（PRL）對毛囊體

4、外生長發(fā)育和形態(tài)的影響。每天在倒置顯微鏡下觀察毛囊形態(tài)，并用測微尺度量毛纖維的生長數(shù)據(jù)，計算毛囊前9天的生長速度和最終的生長長度。結果顯示：向無血清的Williams E培養(yǎng)基中添加2-10ng/mL濃度的VEGF和IGF-I細胞因子有明顯的促進毛囊發(fā)育和毛發(fā)生長的作用；向無血清的Williams E培養(yǎng)基和無血清的DMEM培養(yǎng)基中加入10ng/mL濃度的IGF-I，可刺激毛囊外根鞘細胞向一側增殖、遷移，從而使整個毛囊形成彎曲。

5、　　 三、體外培養(yǎng)條件下毛囊形態(tài)的變化及其影響因素
　　 毛囊在體外培養(yǎng)條件下，初期的生長發(fā)育和在體內皮膚中的發(fā)育區(qū)別不大。毛球呈圓球形，毛乳頭明顯，結締組織性鞘細胞纖維規(guī)則排列，與毛母質界限分明，呈錐形嵌入，毛干及內、外根鞘之間的界限清晰。在加入IGF-I、VEGF等生長因子初期，毛乳頭仍清晰，毛囊的生長表現(xiàn)為毛干及內、外根鞘的延長，而結締組織鞘無明顯變化。隨著培養(yǎng)時間的延長，毛干與內皮根鞘之間的界限會逐漸變得模糊。在培養(yǎng)的

6、后期，毛囊形態(tài)結構會發(fā)生明顯的變化，主要表現(xiàn)為，毛球變成為長桿狀，變細而失去圓形；毛乳頭不明顯或消失，毛母質細胞分裂減弱；內根鞘與外根鞘界限模糊；結締組織性鞘細胞纖維排列雜亂，結締組織細胞減少。隨著培養(yǎng)時間的繼續(xù)延長，毛母質萎縮，遠離毛乳頭；毛乳頭變小而聚縮成團；毛囊的層次結構界限模糊；毛球部扭曲變形?？傊?，整個毛囊失去典型的結構特征，最終毛囊根部呈杵狀，毛囊停止生長。
　　 四、青山羊皮膚成纖維細胞系的建立和維持
　　

7、 采用組織塊法原代培養(yǎng)青山羊皮膚成纖維細胞并進行傳代，將新鮮的青山羊皮膚組織切成1mm3大小的組織塊，放入優(yōu)化的培養(yǎng)基中進行體外培養(yǎng)。通過傳代、純化與凍存等精心管理，成功建立了和維持了青山羊皮膚成纖維細胞系。
　　 五、青山羊毛囊外根鞘細胞系的建立和長期保存
　　 采用酶消化與機械拔除相結合的方法分離出完整毛囊，立即放入優(yōu)化的培養(yǎng)基中進行體外原代培養(yǎng)，通過換液、傳代、純化與凍存等精心操作，成功建立和維持了青山羊毛囊外根鞘