山羊小腸上皮細胞系的建立及其對氮素的利用研究.pdf

1、建立小腸黏膜上皮細胞系，一方面可以從體外直接研究小腸上皮細胞的生物學特征、細胞增殖和分化的調控，以及小腸上皮細胞的營養(yǎng)和代謝，并克服飼養(yǎng)動物所耗用的巨大代價。另一方面，不同類群的腸細胞之間廣泛地相互作用使得試驗研究極其困難，而體外細胞培養(yǎng)為研究腸上皮細胞消化吸收營養(yǎng)物質和腸屏障損傷提供了簡單、快速和準確的手段，并為研究營養(yǎng)素對腸上皮細胞的作用提供了理想的體外模型。 本試驗使用了多種酶消化方法分離新生山羊小腸上皮細胞，結果發(fā)現(xiàn)使用

2、．200U/mL膠原酶I和100 U/mL透明質酸酶來分離剛出生未進奶的山羊小腸上皮細胞，二次消化獲得完整隱窩單位，并具有較強的增殖能力，倒置顯微鏡下觀察培養(yǎng)細胞為多邊形，單層生長不重疊，呈鋪路石狀排列。聯(lián)合使用刮除法、相差消化法、相差貼壁法純化獲得的原代細胞，得到純度達80％的第三代小腸上皮細胞。用膠原酶Ⅺ/中性蛋白酶Ⅰ、嗜熱菌蛋白酶消化原代可以獲得IEC，但是傳代后細胞難以貼壁，增殖能力弱；膠原酶Ⅰ消化獲得的細胞大部分都為成纖維細胞

3、。 對獲得的第三代小腸上皮細胞，用無限稀釋法進行單細胞克隆，經過克隆的IEC能成功傳代到第十代。對獲得的山羊小腸上皮細胞系進行細胞生物學檢測，包括細胞免疫組化鑒定、細胞生長動力學檢測、不同凍存和復蘇方法的研究。結果表明，免疫組化鑒定呈陽性；細胞凍存液Ⅰ、凍存方法Ⅲ能使細胞復蘇成活率達到85％，復蘇后的山羊小腸上皮細胞，其形態(tài)、增殖速度均與凍存前是一致的。 本試驗采用MTT顯色法研究了谷氨酰胺、精氨酸以及兩者聯(lián)合對培養(yǎng)的第

4、五代小腸上皮細胞生長和分化的影響，結果表明，谷氨酰胺和精氨酸均能促進IEC增殖，谷氨酰胺促進IEC分化，但是精氨酸抑制IEC分化，谷氨酰胺和精氨酸兩者聯(lián)合后盡管仍然有促進IEC生長的作用，但與谷氨酰胺單一因子的作用比較，聯(lián)合后對腸上皮細胞的營養(yǎng)作用明顯降低。同時以山羊小腸上皮細胞作為模型，體外培養(yǎng)該細胞過程中觀察培養(yǎng)液氨基酸成分動態(tài)變化，來研究山羊小腸上皮細胞對氨基酸的代謝作用。結果表明，組氨酸、精氨酸、蘇氨酸和亮氨酸是小腸上皮細胞快速