山羊小腸上皮細(xì)胞系的建立及其對(duì)氮素的利用研究.pdf

1、建立小腸黏膜上皮細(xì)胞系，一方面可以從體外直接研究小腸上皮細(xì)胞的生物學(xué)特征、細(xì)胞增殖和分化的調(diào)控，以及小腸上皮細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)和代謝，并克服飼養(yǎng)動(dòng)物所耗用的巨大代價(jià)。另一方面，不同類群的腸細(xì)胞之間廣泛地相互作用使得試驗(yàn)研究極其困難，而體外細(xì)胞培養(yǎng)為研究腸上皮細(xì)胞消化吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和腸屏障損傷提供了簡(jiǎn)單、快速和準(zhǔn)確的手段，并為研究營(yíng)養(yǎng)素對(duì)腸上皮細(xì)胞的作用提供了理想的體外模型。 本試驗(yàn)使用了多種酶消化方法分離新生山羊小腸上皮細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)使用

2、．200U/mL膠原酶I和100 U/mL透明質(zhì)酸酶來分離剛出生未進(jìn)奶的山羊小腸上皮細(xì)胞，二次消化獲得完整隱窩單位，并具有較強(qiáng)的增殖能力，倒置顯微鏡下觀察培養(yǎng)細(xì)胞為多邊形，單層生長(zhǎng)不重疊，呈鋪路石狀排列。聯(lián)合使用刮除法、相差消化法、相差貼壁法純化獲得的原代細(xì)胞，得到純度達(dá)80％的第三代小腸上皮細(xì)胞。用膠原酶Ⅺ/中性蛋白酶Ⅰ、嗜熱菌蛋白酶消化原代可以獲得IEC，但是傳代后細(xì)胞難以貼壁，增殖能力弱；膠原酶Ⅰ消化獲得的細(xì)胞大部分都為成纖維細(xì)胞

3、。 對(duì)獲得的第三代小腸上皮細(xì)胞，用無限稀釋法進(jìn)行單細(xì)胞克隆，經(jīng)過克隆的IEC能成功傳代到第十代。對(duì)獲得的山羊小腸上皮細(xì)胞系進(jìn)行細(xì)胞生物學(xué)檢測(cè)，包括細(xì)胞免疫組化鑒定、細(xì)胞生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)檢測(cè)、不同凍存和復(fù)蘇方法的研究。結(jié)果表明，免疫組化鑒定呈陽(yáng)性；細(xì)胞凍存液Ⅰ、凍存方法Ⅲ能使細(xì)胞復(fù)蘇成活率達(dá)到85％，復(fù)蘇后的山羊小腸上皮細(xì)胞，其形態(tài)、增殖速度均與凍存前是一致的。 本試驗(yàn)采用MTT顯色法研究了谷氨酰胺、精氨酸以及兩者聯(lián)合對(duì)培養(yǎng)的第

4、五代小腸上皮細(xì)胞生長(zhǎng)和分化的影響，結(jié)果表明，谷氨酰胺和精氨酸均能促進(jìn)IEC增殖，谷氨酰胺促進(jìn)IEC分化，但是精氨酸抑制IEC分化，谷氨酰胺和精氨酸兩者聯(lián)合后盡管仍然有促進(jìn)IEC生長(zhǎng)的作用，但與谷氨酰胺單一因子的作用比較，聯(lián)合后對(duì)腸上皮細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)作用明顯降低。同時(shí)以山羊小腸上皮細(xì)胞作為模型，體外培養(yǎng)該細(xì)胞過程中觀察培養(yǎng)液氨基酸成分動(dòng)態(tài)變化，來研究山羊小腸上皮細(xì)胞對(duì)氨基酸的代謝作用。結(jié)果表明，組氨酸、精氨酸、蘇氨酸和亮氨酸是小腸上皮細(xì)胞快速