永生化豬肝細胞系的建立及其鑒定.pdf

1、各種原因所致的急慢性肝功能衰竭,因其病情危重,進展迅速,病死率高,是臨床亟待解決的治療性難題.自人工肝支持系統(tǒng)(artificial liver supportsystem,ALSS)被用于治療各種急性肝功能衰竭,已取得非常好的療效.但是,由于非生物型人工肝缺乏肝細胞的代謝、生物轉化等功能.然而生物型人工肝(bioartificial liver,BAL)依賴于生物反應器中的肝細胞發(fā)揮著肝細胞的氨代謝和生物轉化等重要作用,可以彌補非生物

2、型人工肝的上述缺陷,因此,近年來,以肝細胞為基礎的生物型人工肝是目前人工肝治療肝衰竭的研究熱點,不同類型的BAL不斷出現(xiàn),迄今4種BAL系統(tǒng)業(yè)已開始進行Ⅱ-Ⅲ期臨床驗證,譬如HepatAssist、ELAD等.初步結果證明這些BAL治療是安全、有效的,沒有明顯的不良事件出現(xiàn). 由于供肝的短缺,生物型人工肝的發(fā)展亦面臨著困難.然而,由于豬肝細胞的代謝功能與人肝細胞最為接近,目前大多數(shù)基礎和臨床研究均采用原代豬肝細胞作為肝細胞源.但是,由于

3、原代肝細胞在體外培養(yǎng)時均存在生長條件要求嚴格、存活時間及產(chǎn)量有限、難以傳代等問題,這樣就限制了生物型人工肝的發(fā)展.采用永生化技術建立永生化肝細胞,是解決生物型人工肝細胞來源的重要途徑之一,可為生物型人工肝治療肝衰竭提供大量的肝細胞成為可能. 本實驗采用逆轉錄病毒載體的方法將SV40大T抗原(SV40 LT)和人端粒酶逆轉錄酶(hTERT)導入到原代豬肝細胞,建立永生化豬肝細胞系.將為生物型人工肝系統(tǒng)體外評價、細胞移植、體外藥物代

4、謝模型等提供了理想的肝細胞源.材料與方法首先分子克隆技術分別構建含人端粒酶逆轉錄酶、SV40大T抗原重組逆轉錄病毒載體;用磷酸鈣沉淀法分別將hTERT/pLPCX和SV40 LT/pLXSN轉染至對數(shù)生長期的PT67細胞,經(jīng)嘌呤霉素、G418藥物壓力篩選,建立兩株產(chǎn)毒細胞株,并測定兩種細胞上清的病毒滴度. 其次,用含SV40大T抗原的重組逆轉錄病毒上清感染原代豬肝細胞,G418藥物進行壓力篩選獲得細胞克隆;接著,用含人端粒酶逆轉

5、錄酶的重組逆轉錄病毒上清感染細胞克隆,經(jīng)嘌呤霉素篩選,建立永生化豬肝細胞. 最后,采用倒置顯微鏡、電鏡觀察細胞形態(tài);Western blot法檢測永生化豬肝細胞中端粒酶和SV40大T抗原的表達;RT-PCR檢測永生化豬肝細胞HepLP的ALB mRNA的表達;細胞增殖實驗繪制細胞生長曲線;生化儀檢測細胞上清的丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、乳酸脫氫酶(LDH)等指標; ELISA雙抗體夾心法檢測細胞上清的豬白蛋白;裸鼠致瘤性實驗觀察

6、其有無腫瘤形成、以及進行細胞染色體核型分析. 結果： 成功的構建了hTERT/pLPCX和SV40 LT/pLXSN重組逆轉錄病毒載體,獲得產(chǎn)生含hTERT、SV40 LT重組逆轉錄病毒的兩種細胞株. 用含SV40大T抗原、人端粒酶逆轉錄酶的重組逆轉錄病毒感染原代豬肝細胞,并經(jīng)過篩選后獲得三個耐嘌呤霉素和G418藥物的永生化豬肝細胞克隆;并傳代60代以上.并對其中一個命名為HepLP的永生化豬肝細胞進行鑒定.該細

7、胞均為單層貼壁生長,肝細胞的形態(tài)呈橢圓形、典型的上皮細胞樣特征.在透射電子顯微鏡下,所獲得的豬肝細胞呈典型的肝細胞形態(tài)與結構,細胞內(nèi)豐富的糖原顆粒和大量的線粒體以及內(nèi)質網(wǎng)結構清晰可見; 在掃描電子顯微鏡下,永生化豬肝細胞的表面可見典型的微狀突起物.永生化豬肝細胞呈典型的"S"型生長.永生化豬肝細胞的染色體數(shù)目為38(2倍體). 用Western bllot檢測該細胞的蛋白,在120KD處出現(xiàn)一條陽性帶,表明該細胞系表達端粒酶;在

8、93KD處出現(xiàn)條帶,表明該細胞系也表達SV40大T抗原.以原代豬肝細胞為陽性對照,一步法RT-PCR擴增檢測結果顯示:第6代,第22代,47代的永生化豬肝細胞HepLP和原代豬肝細胞在270 bp處均出現(xiàn)DNA條帶,表明該永生化豬肝細胞具有表達ALB mRNA的等肝細胞基本生物學功能. 在永生化豬肝細胞的培養(yǎng)上清中均可檢測到谷丙轉氨酶(ALT)、谷草轉氨酶(AST)、乳酸脫氫酶(LDH)、尿素氮(BUN)的分泌.采用ELISA雙

9、抗體夾心法可檢測到永生化豬肝細胞培養(yǎng)上清的特異性豬白蛋白的分泌.裸鼠致瘤性試驗顯示注射永生化豬肝細胞的裸鼠6個月后仍沒有觀察到腫瘤. 結論： 1.構建了hTERT/pLPCX和SV40 LT/pLXSN重組逆轉錄病毒載體. 2. 建立了含hTERT基因、SV40 LT基因的重組逆轉錄病毒的兩種產(chǎn)毒細胞株. 3.創(chuàng)建了永生化豬肝細胞的制備方法,并申請發(fā)明專利.將為人源性肝細胞、肝非實質細胞等其他細胞的永生化