EB病毒相關永生化的人B淋巴細胞系的建立和stathmin 1基因的功能研究.pdf

1、EB病毒(Epstein-BarrVirus，EBV)在人群中普遍易感，與人類傳染性單核細胞增多癥、Burkitt's淋巴瘤、鼻咽癌(nasopharyngealcarcinoma，NPC)等多種疾病相關。在體內，EB病毒只能感染人上皮細胞和B淋巴細胞；在體外，EB病毒能轉化靜止期B淋巴細胞使其永生化(immortalization)。目前關于EB病毒致病機制的研究結果相當一部分來自與病毒相關的人永生化B淋巴細胞。 靜止期B細胞

2、是終末分化細胞，在沒有抗原刺激時不能進行有絲分裂。永生化B淋巴細胞也叫淋巴母細胞(lymphoblastoidcelllines，LCLs)，能持續(xù)不斷的分裂增殖傳代，可以有效保留B細胞的遺傳信息，因此可以作為一種細胞模型用于多種寶貴疾病資料的保存以及回顧性研究。 LCL的永生化機制雖經(jīng)多年研究，仍未解釋清楚。已有研究資料揭示該永生化過程非常復雜，與EB病毒的潛伏膜蛋白(latentmembraneprotein，LMP)、病毒

3、核抗原(nuclearantigen，NA)以及淋巴細胞癌基因、抑癌基因等多種分子有關。研究表明在LCL形成早期有一過性的stathmin蛋白表達水平增高，推測stathmin在B細胞永生化過程中發(fā)揮重要作用。 Stathmin1是普遍表達于真核細胞的一種微管調節(jié)蛋白，其表達水平在不同組織細胞中有較大差異。在更新較快、生長旺盛的組織，如骨髓和睪丸中表達水平較高，而在成人腦、脊髓等組織中的表達水平較低；另外，在部分腫瘤細胞如白血病

4、細胞、淋巴瘤細胞、前列腺癌、肺癌、卵巢癌、神經(jīng)系統(tǒng)膠質瘤細胞中也有較高水平的stathmin1表達。 已證實Stathmin1可以直接和微管亞單位α/β二聚體相互作用形成stathmin1-α/β蛋白三聚體抑制微管蛋白的聚合；此外，stathmin1還可以促進微管塌陷。部分研究結果顯示細胞內stathmin1的穩(wěn)定表達對于細胞維持生長狀態(tài)具有非常重要的意義，人為增加或者降低stathmin1表達水平可以明顯阻斷腫瘤細胞的增殖分裂

5、。同樣，stathmin1正?？臻g結構所依賴的氨基酸序列對于其發(fā)揮微管調節(jié)功能意義重大。149個氨基酸構成的單肽鏈結構，N末端、C末端靠近肽鏈中間部分都能對stathmin1-α/β蛋白三聚體的穩(wěn)定起到促進作用，但是只有C末端通過增加GTP酶活性水解GTP降低微管穩(wěn)定性，促進微管解聚。C末端7個氨基酸的缺失可以明顯減弱stathmin1的微管解聚作用。 Stathmin1分子上有四個磷酸化位點，磷酸化水平?jīng)Q定了stathmin1

6、的功能狀態(tài)，當四個位點全部都被磷酸化以后stathmin1失活。在細胞有絲分裂過程中，stathmin1通過不斷調節(jié)磷酸化/去磷酸化過程而影響微管的組裝與解聚，從而影響紡錘體的形成與降解。在有絲分裂間期，stathmin1處于非磷酸化狀態(tài)，參與微管組裝/去組裝的調節(jié)，維持細胞正常狀態(tài)；有絲分裂早期，stathmin1被磷酸化，微管蛋白組裝成微管，進而形成有絲分裂必須的紡錘體；有絲分裂后期，stathmin1去磷酸化，微管解聚，紡錘體消失

7、，細胞退出有絲分裂。在細胞周期中stathmin1的磷酸化/去磷酸化水平需要多次改變以維持細胞的正常分裂。因此，stathmin1和細胞生長增殖密切相關，已經(jīng)成為一個抗腫瘤的研究熱點。有報道稱stathmin1參與了EB病毒相關的B淋巴細胞的永生化過程。 世界上80％的鼻咽癌患者出現(xiàn)在我國廣東省。95％的鼻咽癌患者臨床組織分型為低分化鱗癌或者未分化癌，常規(guī)治療方法首選放療，必要時結合化療，療效較好，但副作用較明顯。運用分子生物學

8、方法針對鼻咽癌細胞低分化株凋亡的研究可能會為鼻咽癌生物治療提供一定理論依據(jù)。 本課題用活病毒感染人靜止期B淋巴細胞，建立了永生化B淋巴細胞系并對其生物學性狀做了初步鑒定；著眼于stathmin1，利用分子生物學技術克隆其基因全序列到穿梭質粒中構建stathmin1野生型克隆載體，設計并構建其突變體，同時利用兩步PCR法構建三個針對stathmin1的干擾載體。在以正常人黑色素細胞為代表的正常細胞株以及鼻咽癌低分化鱗癌CNE-2細

9、胞株為代表的惡性腫瘤細胞中研究stathmin1對于細胞生長增殖的意義，探討stathmin1與細胞凋亡的關系。 主要研究方法和結果如下： 1、培養(yǎng)B95-8細胞，收集懸液，過濾獲得EBV活病毒，感染人外周血淋巴細胞使B細胞永生化獲得成功。細胞可以不斷傳代培養(yǎng)，流式細胞儀檢測細胞生長旺盛，未出現(xiàn)凋亡峰。對永生化細胞利用流式細胞儀分析LCL細胞表面的白細胞分化抗原，結果為CD19陽性，確定其細胞來源為B淋巴細胞。RT-PC

10、R方法檢測細胞內EBV潛伏膜蛋白1基因表達陽性證明永生化與EB病毒相關。對永生化細胞進行核型分析表明永生化早期的細胞核型正常，沒有染色體的結構畸變。 2、兩步PCR法擴增得到三段針對stathmin1mRNA的帶有U6啟動子的shRNA編碼框SEC(shRNAexpressingcassette)。設計引物從穿梭質粒pAdTrack中克隆出帶有CMV啟動子的綠色熒光蛋白基因全序列(CMV-EGFP)，對pBluescriptII

11、KS(+)質粒進行熒光化改造，成功構建用于RNA干擾的載體pBlue-EGFP-U6-si1/2/3并經(jīng)測序鑒定。 3、設計引物從人肺癌細胞A549中利用RT-PCR方法調取stathmin1基因全長，電穿孔轉化法成功構建克隆載體pAdTrack-stathmin1。蛋白質在線數(shù)據(jù)庫SWISS-PROT設計Stathmin1C末端突變體，在pAdTraek-stathmin1基礎上成功構建突變克隆載體pAdTrack-stath

12、min1-mut，并經(jīng)測序鑒定。 4、脂質體法轉染stathmin1克隆載體、突變載體以及RNA干擾載體到正常人黑色素細胞以及人鼻咽癌CNE-2細胞株中。分別觀察過表達、沉默或突變體stathmin1對CNE-2細胞以及黑色素細胞生長的影響。MTT法繪制不同stathmin1表達狀態(tài)下細胞的生長曲線，Hoechst33258以及溴化乙啶(ethidiumbromide，EB)分別染色以及流式細胞儀檢測細胞凋亡率改變，并對黑色素細

13、胞特有功能進行檢測。RT-PCR以及Westernblot結果顯示干擾載體以及過表達載體能有效的在mRNA水平和蛋白質水平改變stathmin1的表達。間接免疫熒光法對CNE-2細胞β-Tubulin染色，激光共聚焦顯微鏡觀察細胞骨架形態(tài)改變。stathmin1的異常表達可以造成細胞生長明顯受抑，凋亡率顯著增加，基于微管的細胞骨架明顯受到破壞，黑色素產量以及酪氨酸酶活性明顯降低。 結論以及研究意義： 1、EB病毒永生化的

14、正常人B淋巴細胞生長旺盛，能不斷傳代，可以作為一種細胞模型用于某些疾病資料的保存。 2、對質粒pBluescriptIIKS(+)熒光化改造成功，可以直接用于構建針對其它基因的RNA干擾載體；正負向表達調控質粒能有效改變stathmin1在細胞內的表達水平，說明RNA干擾靶點的選擇是基因特異的，3’端非翻譯區(qū)也可以存在有效靶點；突變載體和過表達載體轉染的細胞stathmin1表達水平接近，表明C端三個氨基酸突變不會影響stath